家蚕转基因载体件的结构优化及在基因功能分析中的应用研究.pdfVIP

摘要 家蚕既是支撑蚕丝产业的生物基础，又是鳞翅目昆虫研究的典型模式种类，同时， 也是开发新一代生物反应器和新型昆虫产业的材料。近几年来对其的科学研究所取得的 成果具有较高的学术价值，代表了国际同领域的先进水平，特别是在遗传连锁图谱、家 蚕基因组序列与结构等方面，使得结构基因组学开始过渡到了功能基因组学。在家蚕中 基因功能的研究方法很多，转基因技术不乏为一个很优秀的手段。本文就有关基因功能 研究中的家蚕转基因技术和方法开展了一些研究工作，主要的研究内容和得到的结果如 下： 1、家蚕转基因效率与转座子内部序列的相关分析 用该项技术来进行家蚕生物反应器和家蚕具有潜在经济性能的功能基因研究。然而该项 技术的显微注射费时费力，而且成功率仅在3‰5％之间，不利于它的大规模推广与应用。 为了提高家蚕转基因成功率，我们咖唧ac转座子载体进行了改造，敲除了载体中的 冗余序列，构建得到了四种不同左右臂长度组合的转座子，分别进行了细胞水平和转基 因家蚕水平的检测，其中左臂长333 bp、右臂长179bp的转座子效率最高，经多次转基 因实验证实，此种载体能将家蚕转基因效率提高2～7倍，更有利于开展家蚕转基因的研 究． 2、家蚕hsp70启动子的克隆及功能研究 mori 通过PCR的方法克隆得到家蚕热激蛋白70基因(Bombyx hsp70)的5’侧翼的两 个长度分别为538 bp和305 Shock 两段序列在TATA序列的上游存在保守的热激元件(HeatElement，HSE) 现出热激活性，转基因家蚕实验证I非]hsp70．305在家蚕个体中也具有热激活性，可以认为 这两个片段具有hsp70热激启动子特性，便于在家蚕中进行条件诱导的研究． 3、IRES在家蚕表达系统中的应用 virus，I沁V)的四种不同长度的的内 padi EMCV)和禾谷缢管蚜虫病毒(Rhopalosiphum 部核糖体进入序列(InternalRibosome Entry 双荧光载体中，通过Bac．tO．Bae的方法得到了相应的重组病毒后，在细胞及家蚕的3个组 织中比较了它们的活性，结果显示IRES593的活性最高，家蚕组织中以中部丝腺的活性 最高，其次是脂肪体和后部丝腺。 4、启动子陷阱在家蚕基因功能研究应用中的技术探讨 启动子陷阱是一种高通量、既能制造突变体同时又能得到被突变基因序列的研究方 法，在陷阱系统的设计上我们综合了如上所述的3点成果，构建得到了两种转基因家蚕， 的初步研究结果表明：第一，由组成型启动子A3控制表达的转座酶能更有效地启动家蚕 中转座子的再转座；第二，由于转座臂内可能残留；有piggyBac转座酶启动子，因此陷阱 中报告基因的方向应与原始转座酶的方向相反。 5、p国眇Bac转座子插入位点特性的分析 为更好的利用p辔秒Bauc转座子，本文还分析了p删ac转座子在转基因家蚕基因组 中的整合位点特征，得知有6％插入到内含子，12％插入到外显子，8％插入到基因的5’ 末端，3％插入到基因的3’末端，18％插入到了重复序列，53％插入到了基因间序列。 本论文所取得的成果为基因功能研究提供了参考，为家蚕转基因效率的提高提供了 技术储备，同时也为基因陷阱研究奠定了一定的研究基础。 关键词：家蚕；转基因；启动子陷阱；hsp70启动子；内部核糖体进入序列；转座酶 Ⅱ Abstract not the foundationofthe The biological silkworm,Bombyxmori，isonly