应用mrna差显示技术筛选猪前脂肪细胞分化相关的基因.pdfVIP

应用mRNA差异显示技术筛选猪前脂肪细胞分化相关 的基因 摘要 脂肪组织的生长与脂肪细胞体积增大及前脂肪细胞分化成脂肪细胞有关。在前脂 肪细胞分化过程中伴随着许多基因的特异性表达，细胞形态亦有相应的变化。猪是脂 肪沉积能力很强的动物之一，脂肪在皮下组织和内脏器官的过度沉积是影响猪肉品质 的重要因素。本研究采用mRNA差异显示技术筛选猪前脂肪细胞分化过程相关的差 异表达基因，为进一步研究猪脂肪沉积代谢的调控机制提供科学依据。 试验1、猪前脂肪细胞的分离与鉴定 取3日龄健康仔猪颈部皮下脂肪组织，利用胶原酶消化法分离猪前脂肪细胞，进 行原代培养，并采用MTT法、油红O染色、LPL活性测定来鉴定猪前脂肪细胞。结 果显示，体外培养的猪前脂肪细胞在经历短暂的迟缓期后，进入对数生长期，直至第 7天开始进入平台期，在培养第lO天开始出现细胞调亡。细胞形态学观察发现，原 代培养的猪前脂肪细胞从第3天开始充脂，细胞内脂肪滴被油红O染成红色，此后 伴随细胞增殖和分化，充脂细胞逐渐增多，小脂滴不断汇聚形成大脂滴，细胞也由梭 形逐渐变圆，体积增大。同时，LPL活性也呈现先上升后下降的变化趋势。上述结果 证实猪前脂肪细胞已被成功分离。 试验2、猪前脂肪细胞分化过程差异表达基因的筛选 为进一步探讨猪前脂肪细胞分化过程中可能表达的调控基因，采用mRNA差异 显示技术来筛选与其分化有关的差异表达基因。分别收集原代培养3天、5天、7天、 胺凝胶电泳，银染显色后，回收差异条带，并用PCR扩增，扩增片段克隆至pMDl8-T 载体中，测定其核苷酸序列，并将测序结果与Genbank中相关基因序列进行同源性比 较。结果表明： C21、C62、C81等8个基因ESTs序列为本研究首次发现。 脂肪细胞原代培养的第3天和第5天，可能与前脂肪细胞增殖有关；A22在前脂肪细 胞培养的第3、5、7天表达，在第10天没有表达或者是表达量很低，推测A22的表 达与前脂肪细胞增殖、分化的转换和调节有关；B41在培养第5、7天表达，可能与 脂肪细胞的增殖有关；B42、C81在前脂肪细胞培养的第5、7、10天表达，可能与脂 天和第10天表达，与脂肪细胞分化进程有关：A55与人的PURB基因同源性达到93％， 尚不清楚A55是否参与脂肪细胞增殖或分化的调节。 关键词：猪，脂肪细胞，细胞增殖，细胞分化，差异显示，差异表达 Ⅱ S oftheGenesAssociatedwithPorcine creening DifferentiationmRNADifferential Preadipocytes by Display Abstract tissue involvesallincreasein sizeandtheformationof Adiposegrowth adipocyte new the differentiation adipocytes觚preadipocytes．Duringpreadipocyte process，is are andthecell are changedaccordingly． manyspecificgenesexpressed morphology animal fat thefatexcessive Porcineisoneofthe whichhas greatestdepositcapacity,and accumulationinsubcutaneoustissueandinternal isan