湖羊瘤胃微生物osmid文库中内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究.pdfVIP

浙江大学硕士论文 中文摘要 中文摘要 从湖羊瘤胃Fosmid文库的12，704个克隆中，通过刚果红染色分析获得16 个具有内切葡聚糖酶活性的阳性克隆。根据阳性克隆透明圈大小从中选取两个 码内切葡聚糖酶的ORF，编码359个氨基酸，该蛋白含有一个糖基水解酶家族 crossotusDSM 2876的内 5(GH5)的结构域(plat000150)。该结构域与Butyrivibrio 切葡聚糖酶同源性最高，氨基酸序列相似性为72％。HFl26中含有1个编码内 切葡聚糖酶的ORF，编码759个氨基酸，该蛋白含有三个结构域，分别为 域与Butyrivibriofibrisolvens 基酸序列相似性为85％。 相连接，导入Ecoli IPTG诱导表达5 BL21(DE：3)构建基因工程菌。分别经lmM h和10h后，菌体破碎离心取上清，点样于羧甲基纤维素钠平板，39oC培养3h， 经刚果红染色，在平板上可见明显的透明圈，表明表达产物EHFecl05以及 EHFecl26都具有羧甲基纤维素酶活性；进一步用SDS．PAGE和Westernblot进 行分析检测，EHFecl05蛋白分子量约为45kDa与推导的融合蛋白分子量一致， EHFecl26蛋白分子量在95．130kDa之间，比推到的融合蛋白分子量89kDa稍大。 破碎上清液经6xHis亲和层析纯化，分析纯化酶丘c105和月乳c126对于不同 底物的水解活性。结果显示，丘砘c105对CMC底物和13．葡聚糖底物的比活性分 别为7．21 底物和B一葡聚糖底物的比活性分别为3．76 U／mg和23．39U／rag，最适反应温度为 40。C，最适pH为6．O；而两者对p-NPG、微晶纤维素以及木聚糖均没有水解作用。 将HFecl05基因的成熟肽序列与pGAPZaA载体相连接，电击转化毕赤酵母 GSll5构建重组酵母工程菌GSl 连续发酵120h，分别收集48，72，96和120h表达上清点样于羧甲基纤维素钠平 板，39。C培养3h，经刚果红染色，平板上可见明显的透明圈，表明表达产物 浙江大学硕士论文 中文摘要 组蛋白GSHFecl05水解CMC和于13一葡聚糖的比活性分别为8．71U／mg和8．35 U／mg。 关键词：Fosmid文库；内切葡聚糖酶；酶学性质；大肠杆菌；毕赤酵母 2 浙江大学硕士论文 英文摘要 Abstract forcellulasefromafosmid from This WaS toscreen studydesigned gene library ruminalcontentofHu clones sheep．Sixteenpositive expressingendoglucanase wereisolated functional of1 colonies．Two 2，704 positive activity through screening andHFl selectedforfurtherbaSedonthe of 05 clones(HFl26)were study compariso