苦豆子内生放线多样性及其抗生素合成酶基因的挖掘.pdfVIP

项目资助 1．宁夏回族自治区科技支撑计划项目“宁夏天然草场沙生药用植物内生 放线菌多样性及农用抗生素研究”(项目获批号：NG2013) 2．国家自然科学基金“宁夏干旱荒漠区苦豆子内生菌多样性及其农用抑 菌活性物质研究(项目获批号” 3．国家科技支撑计划课题“酿酒葡萄优质稳产绿色高效栽培技术研究与 示范”(2013BAD09802) 摘要 植物内生放线菌是指生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内的一类放线 菌，普遍存在于目前发现的各种陆生及水生植物中。不同的气候条件、区域或位点、植被等都 可以影响内生放线菌的多样性。已有研究发现药用植物内生放线菌作为一类新的微生物资源具 有很好的开发潜力、药用价值及潜在的商业价值，这些内生放线菌与宿主之间的生态关系极为 紧密，它们所产生的次生代谢产物在植物病虫害生物防治、医药等方面的用途正在逐渐增大， 已经成为寻找新的天然活性产物的重要途径。本文以宁夏白芨滩自然保护区的沙生药用植物苦 豆子为研究对象，利用生物学、分子生物学和化学指纹分析，进行了内生放线菌多样性分析； 抑菌活性菌株的筛选；抗生素PKS和NRPS功能基因菌株的挖掘以种类鉴定，并对功能菌株产生 的抗生素类型进行高效液相色谱分析。研究结果如下： 1、从宁夏白芨滩国家级自然保护区不同植被和土壤类型的6个样区采集健康的苦豆子样品 30份，从中共分离得到111株内生放线菌。内生放线菌数量分布以根部最多，其次为种子，叶 部最少；土壤类型为淡灰钙土时苦豆子内生放线菌数量比土壤类型为风沙土时多；结合形态学 特征和16S (Thermoleophilum)都为稀有属。 2、以15种植物病原真菌为靶标菌，对19株苦豆子内生放线菌抑菌活性菌株进行进一步的 抗菌活性筛选。采用皿内对峙培养法培养7d左右观察结果，结果表明17株菌株对番茄叶霉病 solan)和小麦赤霉病菌 菌(Fulviafutva)都有抑菌活性；16株菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia (Fusarium 7aponica)的抑菌圈半径最大达到17．58mm；YCZKDS4对水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)的抑 菌圈半径最大达到15．62mln。制备菌株YWZKDS4发酵液直接喷施于葡萄炭疽病果，进行田间 测试，结果发现菌株YWZKDS4的平均防效为61．27％。 3、设计放线菌抗生素聚酮合成酶基因PKSI和PKSII和非核糖体多肽基因NRPS引物，对 19株苦豆子高活性抑菌菌株进行特异性扩增。结果表明共有11株菌株为阳性菌株，PKSI基因 阳性菌株率为47．4％，PKSII基因阳性菌株率为10．5％，NRPS基因阳性菌株率为21．1％。根据 于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)。 4、对11株PKSI、PKSII和NRPS基因阳性菌株产抗生素进行薄层色谱和高效液相色谱分 素。 关键词：苦豆子内生放线菌，多样性，抑菌活性，抗生素合成酶基因，高效液相色谱 Abstract microbialwhichwere in all wasinthesame of Endophyticactinomycetes category livingplants ora oftheir were intheallkindsofterrestrialand whichhad part lives，theywidespread aquaticplants areasor wasinfluenced asdifferent site， beenfound．Their factors，such cu