实验八细胞电泳要点.pptVIP

分 类 按支持介质的不同可分为：⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis）⑵ 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）⑶ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 2.按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ；??⑵ 板电泳 ；??⑶ 柱电泳 1.材料： 鼠全血细胞、菠菜叶绿体 2.器具： 细胞电泳仪，普通光学显微镜，电子表，台微尺，目微尺，细胞电泳架，电泳毛细管，吸血量管，洗耳球，盐桥等。 显微观察电泳槽 安放玻璃小室 电泳结束，取出玻璃小室 了解细胞电泳的原理及意义，学习细胞（包括细胞器）电泳速度及其ζ电位的测定方法。 通过哺乳动物红细胞电泳现象的观察和电泳速度的测定实验，掌握细胞电泳技术的实验操作。 通过实验了解细胞电泳技术在研究生命科学中的重要作用。 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 细胞表面具有一定的电荷(通常为负电荷)，其表面吸附着被极化的水分子层，它与介质间存在着电位差，此电位差称为ζ电位。 每种细胞在恒定的条件下(如温度、电压、电流、介质浓度、pH值等)其电泳速度和ζ电位十分稳定，但在各种有害因子或病理状态的影响下，可降低其表面电荷，所以细胞的电泳速度和ζ电位值产生变化(降低)。因此，利用细胞电泳手段研究生命结构的表面性质，鉴定细胞或单细胞有机体的功能和病理状态具有重要的意义。 在外界附加电场作用于多相系统时，可使该系统产生相位移效应，称为电动现象，属于该电动现象的包括电泳和电渗透。 在电场作用下，液体介质中带电悬浮质点与介质间的相对运动，称为电泳。 将细胞制备成悬浮溶液，使其单个游离的细胞分散于等渗的介质中，在电场作用下，细胞在电泳室内发生运动，这种现象称为细胞电泳。 电泳介质： (1)生理盐水甘油溶液：0.9％NaCl液，0.32M甘油溶液，每毫升加入4～5IU(国际单位)的肝素混匀后备用；(2)8％蔗糖肝素液：在8％的蔗糖中， 0.32M甘油溶液，每毫升加入4～5IU的肝素混匀后备用；(3)50％血清液：用生理盐水将离心后提取的同种动物的血清配制成50％的介质。因血清中含有抗凝物质，在制备此液后不需再加入其他抗凝剂（肝素）。 （一）前期准备 1.样品的制备：根据实验对象，选择所需介质1mL，再采用血量管或微型移液管吸取浓缩细胞10mm3加入上述介质中，并混匀，备用。 2.盐桥的制备：称取9gNaCl加蒸馏水100mL,溶解后加入0.4g琼脂粉（凝胶作用）加热融化，在加热时不断用玻璃棒搅动，直至全部融化，此时将已洗净晒干的塑料管插入溶液内，使管腔内部被充满，不得留有气栓。 3.网格目镜测微尺的校准: 在显微镜载物台上安装台微尺，转动显微镜镜筒的目镜并移动物镜测微尺，调整目镜测微尺网格的纵线与台微尺的一条细线重合在一起，然后确定二者再次重合时，各自的格个数，用公式X=na/b计算网格的实验刻度。（其中a为0.01mm） 4.显微镜固定及毛细管和银电极的清洁 选可翻转的显微镜以免细胞在电泳时迅速下沉，脱离观察面。用肥皂水冲洗毛细管电泳室，然后用清水冲洗数次。用普通纱布将电泳架两端的银电极擦干净，以免正反两方向的电泳速度显著不一样。 (同细胞大小观察实验) 5.毛细管电泳室静止室的计算（即d/10的测量） 毛细管是长6cm的管腔，成正方形或等边三角形，以玻璃制成的毛细管。电泳室的相对应的内壁中线处各刻有一条与内壁长轴一致的平分线，此线是在电泳测量时观察一定深度的细胞移动的标准。 根据液体力学原理，液体在官腔内流动的速度因其深度的不同，管壁对质点的吸附作用和摩擦作用不同，因此不同深度的质点运动速度是不一致的，管腔中心最快，紧贴管壁出最慢，并且不同部位质点运动的速度与深度间变化成抛物线关系。所以在做电泳速度测量时，在其他因素相对稳定的条件下必须选择固定深度侧量，否则因深度的变化而测定的电泳速度将不能表示出正确的实验数据。 （二）电泳速度及ζ电位的测定 电泳速度 (1)根据所需用的输