实验二沉淀反应要点.pptVIP

* 实验二 沉淀反应 一、实验内容 1.双向琼脂扩散试验(小组做) 2.单向琼脂扩散试验(示教) 3.免疫电泳(示教) 4.火箭电泳(示教) 5.尿液HCG检测(胶体金免疫法) (小组操作) 免疫标记技术 沉淀反应 6.录像：免疫反击战 二、目的与要求 1.掌握单扩、双扩基本原理、方法、结果分析及应用。 2.熟悉免疫电泳基本原理及应用。 3.了解火箭电泳基本原理及方法。 4.认识示教单扩、火箭电泳和免疫电泳的染色片的图形。 5.了解胶体金免疫法检测HCG的原理、方法。 三、讲解内容 （一）沉淀反应的定义 指可溶性Ag与相应Ab在一定条件下发生特异性结合，出现肉眼可见的沉淀物的反应。 可溶性Ag——沉淀原； 相应Ab——沉淀素。 沉淀反应与凝集反应的比较 抗原性质 反应物 稀释对象不同 凝集反应 颗粒性抗原 凝集物 稀释Ab (振摇后不浑浊) (试管凝集) 沉淀反应 可溶性抗原 沉淀物 稀释Ag (振摇后浑浊) （二）沉淀反应的类型 根据Ag和Ab扩散的介质不同分为两大类： 1.在溶液中进行扩散—环状沉淀试验。 2.在琼脂中进行扩散—琼脂扩散试验： 单扩、双扩、火箭电泳、免疫电泳等。 1.环状沉淀试验（介绍） 用途：用于法医学鉴定和昆虫嗜血性鉴定。 2.双向琼脂扩散试验 原理：琼脂凝胶是一种半固体胶状物，里面有无数小孔，Ag、Ab在孔中进行扩散，在比例适合处形成沉淀线，即为阳性反应。 双孔型：Ag、Ab分子质量分析。 三角型： Ag性质分析 梅花孔型： Ag/Ab效价的滴定 双向琼脂扩散试验 用途：抗原或抗体的检测，定性或可粗略定量。 缺点：需时长，灵敏度不高。 3.单向琼脂扩散试验（示教） 用途：已知抗体测抗原，定量实验； 缺点：耗时长。 1 :10 1 :20 1 :40 1 :80 Ag稀释度 4.免疫电泳（示教） 先Ag电泳，后扩散。 注意：1、2孔为Ag样本孔。 1 2 免疫电泳的用途： A.用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断； B.用于抗原纯度的定性分析。 5.火箭电泳（示教） 用途：已知抗体测抗原，定量实验； 火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场 优点：耗时短，反应敏感性好。 四、操作内容 1.甲胎蛋白(AFP)的检测（小组操作） （1）材料： A.待测Ag： AFP可疑血清； B.阳性对照：AFP阳性血清； C.阴性对照：生理盐水（NS） D.已知抗体：兔抗人AFP。 （2）方法及步骤： A.琼脂反应板制备； B.打孔； C.加样； D.反应(湿盒37℃ 24h)； E.结果分析。 (已知Ag) (已知Ab) （阴性对照） (未知Ag) (未知Ag) (未知Ag) (未知Ag) * 1:32与1:16相吻合 1:16与1:8相吻合 1:8与AFP(+)相吻合 标本中抗原为AFP抗原 * 1:32有沉淀线 1:64无沉淀线 标本中抗原滴度为1:32 E. 结果分析。 （5）注意事项： A.打孔不要划破边缘； B.加样不宜过多，不要溢出； C.反应时间为24h； D.合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。 2.胶体金免疫法检测尿液HCG 人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin, HCG) 受精卵移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。 HCG作为抗原，可以用已知特异性抗体检测尿液中的HCG以诊断早孕。 胶体金免疫法实验原理 胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)。 胶体金颗粒聚集到一定大小后即呈现出红色。 早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心法的检测模式。 1.鼠抗人HCG单抗 (固定的检测线) 2.羊抗鼠IgG(固定的质控线) 尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色 HCG金标试纸 带条中含有均匀分布的胶体金标记的鼠抗人HCG单抗 在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗(IgG)随着尿液上行, 到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。 标志线 *