实验四植物叶绿素的定量与分光光度计的使用要点.pptVIP

植物叶绿素的定量测定及吸收光谱 一、实验目的 学习基本的物质定量测定方法与分光光度计的使用。 学习测定叶绿素总量及吸收光谱的技术 二、实验原理 叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1、原子吸收光谱法： 2、分光光度法： 叶绿素a 和叶绿素b 在649nm 和665nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在649nm、665nm，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。 三、仪器、原料和试剂 分光光度计、天平、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、新鲜的植物叶片、95％乙醇(或80％丙酮)、石英砂、碳酸钙粉 四、操作步骤 1.叶绿素滤液的提取制备： 2.比色与结果计算： 3.吸收光谱曲线测定与绘制 1.叶绿素滤液的提取制备： 叶片0.5g、石英砂和碳酸钙粉、3mL95％乙醇，研磨之糊状；再加乙醇10mL ，研磨至组织变白 。 静置3～5min 。 用滤纸过滤至棕色容量瓶中，少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次 。 定容至25mL。 2.比色与结果计算： 以95％乙醇为空白对照，在波长665nm、649nm 和652nm 下测定滤液的吸光度。 95 ％乙醇提取液中色素浓度计算公式（mg/L）： Ca=13.95A665-6.88A649　　 Cb=24.96A649-7.32A665 叶片色素的含量 　　 五、在96％乙醇中叶绿素的吸收光谱 95％乙醇作空白对照，在400-700nm范围内以20nm间隔测定并记录提取液的光密度读数，在最大吸收部位，以5毫微米为间隔增加读数。 以光密度读数为纵坐标，波长为横坐标，绘叶绿素吸收光谱图。 叶绿素吸收光谱曲线  721型分光光度计的工作原理 分光光度计的基本工作原理 721型分光光度计的构造 721型分光光度计的使用方法 721型分光光度计使用和维护中应注意事项 基本工作原理 物质对光(对光的波长)的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带。当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些光线就会被溶液吸收。 吸光度:是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数。 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。 比尔定律 ：在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系 。A=lg(1/T)=Kbc。  721型分光光度计的构造 721型分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm。 721型分光光度计的使用方法 预热 灵敏度选 择波长选择 T调“0” T调“100%” 测定、读数 完毕 预热：打电源开关，掀开暗箱盖，预热10-20min。 灵敏度选择：将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。） 波长选择：根据所需波长转动波长选择钮。 T调“0”：在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向T=0处。 将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 T调“100%”：盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的T=100。 测定：指针稳定后，逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。 比色完毕：关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。 使用和维护中应注意事项 连续使用不应超过2小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。 比色皿每次使用完毕后，洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。在使用中注意保护比色皿的透光面。 仪器不能受潮。 搬运时注意小心轻放。 * * ——分光光度计的使用 2010.04.07