miR-663通过靶向TGF-beta;1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(1):165-173 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.01.16 miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成 1 1 1 1 2 2 贾小云 ，金雷皓 ，苗潋涓 ，丁 娜 ，范瑞文 ，董常生 1 2 （山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801 ； 山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801 ） 摘要：【目的】预测和验证羊驼 TGF-β1 是 miR-663 的靶基因之一，并对 miR-663 介导的 TGF-β1 在黑色素 生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测miR-663的靶基因，并对靶 基因 3′UTR 区可能的 miR-663 的作用位点进行分析。利用 DNAMAN 软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物 TGF- β1-3′UTR 区的相似性。利用Sac Ⅰ和Xba Ⅰ将羊驼 TGF-β1 基因的 3′UTR 区插入 pmirGLO 构建双荧光报告载 体 pmirGLO-TGF-β1-3′UTR 并与 miR-663 mimic 共转染 293T 细胞，通过测定荧光素酶活性来验证 miR-663 的直 接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染miR-663 mimic来过表达miR-663，并利用qRT-PCR 和Western blotting检测 miR-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在mRNA和蛋白水平的 变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示 miR-663 有 68 个保守的靶基因，包含 74 个保守的靶位点和 44 个非保守靶位点。TGF-β1是 miR-663的靶基因之一，且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF- β1 基因的 3′UTR 区相似性较高且均存在多个保守的 miR-663 靶位点。克隆了羊驼 TGF-β1 基因 3′UTR 区发现 存在3个保守的miR-663靶位点。成功构建包含3个miR-663作用位点的 pmirGLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载 体并与miR-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示：与对照组相比，试验组pmirGLO-TGF- β1-3′UTR + miR-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%，表明TGF-β1 是miR-663直接的靶基因。在羊驼黑色素 细胞中转染 miR-663 mimic 后：miR-663 表达量上调 334 倍，TGF-β1、β-catenin、Smad4 基因的表达量分别下 调89%、41%、34%；TGF-β1蛋白表达量下降了21%，β-catenin蛋白表达量无明显差异；黑色素细胞中的黑色素 含量下降 42%。【结论】TGF-β1是miR-663的直接靶基因。miR-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad 和Wnt信号通路，进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。 关键词：羊驼黑色素细胞；双荧光素酶报告载体；黑色素；miR-663；TGF-β1 Melanin Synthesis of Alpaca Melanocytes Regulated by miR-663 Through Targeting TGF-β1 1 1 1 1 2 2 JIA Xiao-y