褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立与应用.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(3):525-533 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.03.009 褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立与应用 1, 2 2 2 1, 2 2 2 2 2 李玲娣 ，周常勇 ，李中安 ，田 晓 ，王永江 ，唐科志 ，周 彦 ，刘金香 1 2 （西南大学园艺园林学院，重庆 400715 ； 中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712 ） 摘要：【目的】建立SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR 方法，测定褐色橘蚜（Toxoptera citricida ）中柑 橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）含量。【方法】根据CTV CP25 保守序列，设计特异性引物HD-F/R， 通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV 实时荧光定量RT-PCR，并进行灵敏性、重复性检验，评价该方法的可 行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV 含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR 方法最低检测限为9.0 拷贝/μL，其 灵敏度是常规RT-PCR 的100 倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关性系数为0.998，扩增效 率达 104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%，表明该方法重现性好。获毒24 h 单头橘蚜中CTV 最低含量为 3 6 2.5×10 拷贝，最高含量为1.24×10 拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR 检测方法能够准确检测褐 色橘蚜中的CTV，可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV 的流行。 关键词：褐色橘蚜；柑橘衰退病毒；实时荧光定量RT-PCR Development and Application of a Real-Time RT-PCR Approach for Quantification of CTV in Toxoptera citricida 1,2 2 2 1,2 2 LI Ling-di , ZHOU Chang-yong , LI Zhong-an , TIAN Xiao , WANG Yong-jiang , 2 2 2 TANG Ke-zhi , ZHOU Yan , LIU Jin-xiang 1 2 ( College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715; Citrus Research Institute, Chinese Academy of Ag