棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(12):2306-2316 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.003 棉花钠尿肽基因 GhPNP1 的耐旱功能分析 1,2 2 2 2 1 刘小双 ，刘廷利 ，袁洪波 ，张保龙 ，王荣富 1 2 （安徽农业大学生命科学学院，合肥 230061 ； 江苏省农业科学院农业生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室，南京 210014 ） 摘要：【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1 的结构特征、表达模式以及耐旱功能，并分析其耐旱机制，为将该 基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因 AVE1 进行同源性 搜索，得到与 AVE1 蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列；使用 MEGA5 软件对 AVE1 蛋白序列及其同源序列 进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树；利用 MEGA 和 expasy 在线工具进行蛋白序列分析；并根据编 码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥 3503 中克隆到其同源基因 GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析 GhPNP1 的分子特性，包括 GhPNP1 编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧 光定量 PCR（qRT-PCR）分析 GhPNP1 在不同器官部位的组织表达模式以及受到 PEG 模拟干旱胁迫处理后的表达模 式。将 GhPNP1 的 cDNA 序列连入 CLCrV 沉默载体中，构建 GhPNP1 的病毒诱导基因沉默载体 CLCrV:GhPNP1，转入 农杆菌，并通过和辅助载体 CLCrVB 共侵润 2 叶期幼苗进行叶片注射，获得 GhPNP1 的沉默植株。利用 PEG 模拟干 旱处理沉默植株检测其耐旱性，并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC 水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥 3503 中克隆到的GhPNP1 的开放阅读框长 度为396 bp，编码131个氨基酸，信号肽长度为15个氨基酸，通过系统进化树分析 GhPNP1 编码的蛋白含有保守 的钠尿肽结构域，与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1 在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量 较高，PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的 GhPNP1 均上调表达。GhPNP1 沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱 条件下，GhPNP1 沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株；而沉默植株的总抗氧 化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因， 受干旱胁迫诱导上调表达，沉默后耐旱性降低。推测 GhPNP1 可能通过 cGMP 信号途径参与棉花的干旱胁迫，在干 旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。 关键词：陆地棉；病毒诱导的基因沉默；干旱胁迫；功能分析 Drought-Enduring Functional Analysis of a Natriuretic Peptide Gene GhPNP1 in Cotton 1, 2 2 2 2 1 LIU Xiao-shuang , LIU Ting-li , YUAN Hong-bo , ZHANG Bao-long , WANG Rong-fu 1