环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(22):4551-4563 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.22.015 环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析 1,3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 赵洪喜 ，刘军龙 ，李有全 , 杨聪山 ，赵帅阳 ，刘 娟 , 刘爱红 ，谢俊仁 ，田占成 ，刘志杰 ， 刘光远 1 1，2 1 1 , 殷 宏 ，关贵全 ，罗建勋 1 2 （中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室，兰州 730046 ； 江苏省动物重要疫病与人 兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009 3 ； 宁夏大学农学院，银川 750021 ） 摘要：【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata ）可以感染牛 B 淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞，并可 使被感染细胞发生转化，体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和 非转化宿主细胞抑制性消减文库，筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。 【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料，提取总 RNA 和 mRNA，反转录合成 cDNA；然后分别作为 tester 和 driver，进行抑制性消减杂交（SSH），构建环形泰勒虫 转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库；对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析，并利用实时荧光定 量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序，共获得了有效表达序列标签 （ESTs）364 条，大小主要分布在 350—1 200 bp 之间；将这些 ESTs 序列在 GenBank 中进行 BLASTn 网上序列比 对，其匹配于192条基因序列；其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因 序列、7 条为假设蛋白基因序列、5 条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5 条为核糖体蛋白基因序列、4 条为细胞周 期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19 条为肿瘤相 关蛋白基因序列）和1条未知序列；其中已有功能注释的ESTs 285条，再将已知功能的ESTs通过 WEGO软件从生 物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3 个 部分进行GO聚类分析，结果表明，宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物 调节等功能方面。另外，通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析，结果表明， 肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32 倍。【结论】利用 SSH 技术，成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库，筛选获得了转化宿主细胞 和环形泰勒虫裂殖体的表达基因，并通过荧光定量 PCR 分析获得了 2 个可能参与宿主细胞转化的基因，为进步探 索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。 关键词：环形泰勒虫；抑制性消减杂交；ESTs