家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(19):3922-3928 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.022 家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达 罗 娟，陈恩祥，刘红玲，彭芷昕，杨从文，沈关望，张海燕，邢润苗，林 英，夏庆友 （西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室/农业部蚕桑重点实验室，重庆 400716 ） 摘要：【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR），分析其在昆虫细胞中的表达特征， 了解正常VgR 和突变VgR的表达模式，为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR 的基因编码序列 设计特异引物，扩增的目的片段连接到载体pET28a上，构建原核表达载体，转化 E. coil BL21（DE3）表达菌株， IPTG诱导获得目的蛋白；用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白；将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的 兔源多克隆抗体；PCR扩增获得大造和突变型白妙卵 （scanty vitellin，vit ）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V） 片段，连接到细胞表达载体上，通过细胞转染表达目的蛋白，采用细胞免疫组化检测大造和突变型 vit 的 VgR 在 细胞里的表达情况；通过 Western blot 检测细胞培养液中大造和突变型 vit VgR 的表达量。【结果】原核表达获 得了一个大小约为 22 kD 的融合蛋白，以包涵体形式表达；镍柱亲和层析初纯化得到 BmVgR 的肽蛋白，进一步切 胶纯化后，以此为抗原制备 BmVgR 的兔源多克隆抗体，其抗体效价＞1 ﹕512 000，纯度为 95%以上。转录水平检 测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有 BmVgR 和 BmVg 内源基因的表达；在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型 和突变型 vit BmVgR的结构域 SP+LBD1+EGF1肽段，家蚕突变型 vit 在 BmVgR 第1个表皮生长因子同源区域的第 3 个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失；细胞免疫组化试验表明，突变型和正常型的C11V和C11D 都能在 Sf9 细胞质中正常表达；制备的 BmVgR 兔源多克隆抗体和 Myc 标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白， 表明试验所制备的VgR抗体特异性较好；由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽，细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培 养液中，Western blot对培养液进行蛋白检测，表明突变型 vit 存在氨基酸缺失，但并不影响肽蛋白的正常表达， 且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达，可能是其蛋白功 能异常导致突变型 vit 表型产生。 关键词：家蚕；卵黄原蛋白受体；原核表达；细胞表达 Expression of Silkworm Vitellogenin Receptor in Vitro LUO Juan, CHEN En-xiang, LIU Hong-ling, PENG Zhi-xin, YANG Cong-wen, SHEN Guan-wang, ZHANG Hai-yan, XING Run-miao, LIN Ying, XIA Qing-you (State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University/The Key Sericultural Laboratory of Ministry of Agriculture, Chongqing 400716) Abstract: 【Objective 】 The objective of this study is to clone the silkworm BmVgR, to analyze its expression characteristics i