锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(2):273-283 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.007 锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA 克隆、 序列分析及原核表达 付楠霞，翟 枫，姜 鸣，吕淑敏，张雅林 （西北农林科技大学植物保护学院植保资源与病虫害治理教育部重点实验室，陕西杨凌712100 ） 摘要：【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS ）是单萜和倍半萜生物合成途 径分支点的关键酶，获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因（FPPS ）是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文 旨在克隆锯角豆芫菁（Epicauta gorhami Marseul ）FPPS，预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能，并实 现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS 编码蛋白的保守区序列，利用CODEHOP 软件设计简并 引物，利用RT-PCR 获得锯角豆芫菁的cDNA 模板，巢式PCR 扩增锯角豆芫菁FPPS 保守区；随后根据所得的保守区 片段设计特异性引物，运用RACE 技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列；然后根据预测的FPPS 开放阅 读框（ORF ）设计ORF 区特异性引物，巢式PCR 扩增编码区序列；最后用DNAMAN 拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA 序列。运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam 及TargetP 1.1 Server 等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA 序 列、Fps 系统进化关系及其基本理化性质、FPPS 蛋白的亚细胞定位等进行分析；将锯角豆芫菁FPPS 与pET28a （+ ） 连接，构建原核表达载体 pET28a （+ ）-EgFPPS 并将其转入大肠杆菌（Escherichia coli ）BL21 （DE3 ）中，IPTG 诱导融合蛋白的原核表达。分别收集不同诱导时间段的菌液，SDS检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时 段收集的菌液超声波破碎后，分离上清及沉淀并进行煮沸处理，SDS检测融合蛋白的可溶性；Western Blot 印迹杂交验证目的蛋白的表达。【结果】获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS 全长cDNA 序列，命名为EgFPPS （GenBank 登录号 KC840040 ），序列分析结果表明，该基因全长1 857 bp，其中5′非编码区 146 bp，3′非编码区 436 bp，开放阅读框 1 275 bp，共编码 424 个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为 49.2 kD，理论等电点 pI 为8.89，预测分子式为C H N O S ，不稳定系数为38.62，总平均亲水系数为-0.429，为疏水的稳定蛋白。 2192 3457 605 632 25 序列分析发现，锯角豆芫菁与其他 6 种昆虫FPPS 在氨基酸水平上具有 72.56%的同源性，且其近N 端具有R**S 四肽基序，此外还包含7 个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D 的天冬氨酸富含区。系统发育树显示锯 角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近。EgFPPS 的亚细胞定位进行预测发现其N 端具有一段明 -1 显的线粒体靶向肽。原核表达结果表明，该蛋白在终浓度为1 mmol·L 的IPTG 诱导4 h 即能实现融合蛋白的高 效表达；融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在；Western Blot 印迹检测也证实大肠杆菌 DE3 中表达了一个分子量约为49 kD 的蛋白质，与预测分子量大小基本一致。【结论】成功从芫菁科昆虫克隆得 到FPPS，并成功实现了其编码蛋白的原核表达，为后期探索其在芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能 提供理论基础。 关键词：锯角豆芫菁；FPPS；RACE 技术；生物信息学；原核表达 收