抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(3):884-890 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.016 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建 1,2 1 2 1,2 1,2 2 1,2 胡春华 ，龙桂友 ，戴素明 ，马先锋 ，谢玉明 ，李 娜 ，邓子牛 1 2 （湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128 ； 国家柑橘改良中心长沙分中心，长沙 410128 ） 摘要：【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment，ScFv） 基因，为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件，并为构建单链抗体基因植物表达载体，尝试利用 转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠，制 备抗PthA-NLS 多肽单克隆抗体，从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用RT-PCR和 重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）法构建其单链抗体基因，并克隆到pGEM-T载体 和原核表达载体 pET32a(+)中，重组原核表达质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得 了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基 因ScFv，获得的 ScFv 基因大小约750 bp，其中重链可变区（VH）基因有360 bp，轻链可变区（VL）基因有342 bp， 中间连接肽基因 45 bp，经过 IPTG 诱导 ScFv 原核表达，获得了大小为 44.5 kD 的 ScFv 重组蛋白。【结论】试验 获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株，成功构建了 ScFv 基因，并实现了原核表达， 为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。 关键词：柑橘溃疡病；单克隆抗体；单链抗体；pthA 基因 Preparation of Monoclonal Antibody Against PthA-NLS and Construction of the Relative ScFv Gene 1,2 1 2 1,2 1,2 2 1,2 HU Chun-hua , LONG Gui-you , DAI Su-ming , MA Xian-feng , XIE Yu-ming , LI Na , DENG Zi-niu 1 2 ( Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; National Center for Citrus Improvement-Changsha, Changsha