利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕let-7簇microRNAs.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(3):581-592 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.016 利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7簇microRNAs 1,2 1,2 1 1 1 1,2 1,2 何 婷 ，尹 权 ，王 伟 ，黄亚玺 ，吴小燕 ，夏庆友 ，刘仕平 1 2 （西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716 ； 西南大学生物技术学院，重庆 400716 ） 摘要：【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕（ Bombyx mori ）let-7 簇（cluster）microRNAs： bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795，为研究家蚕microRNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA 簇（bmo-let-7 cluster，bmo-let-7-C）上各miRNA前体(pri-let-7、pri-miR-100与pri-miR-2795)和bmo-let-7-C 全长序列，以红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因为报告基因，昆虫细胞表达载体 pFastBac1 为 穿梭载体，通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV) 基因组上，获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid，rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、 Bac-miR-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda ）卵巢细胞系Sf9，72 h 后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号，荧光定量PCR 检测miRNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行离心、收集上 清液，获得具感染力的重组病毒，用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体，72 h后用荧光显微镜检查红 色荧光蛋白信号，荧光定量PCR检测miRNAs 的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各miRNA前体和bmo-let-7-C 全长序列构建到杆状病毒基因组上，获得了各 miRNA 及 bmo-let-7-C 的过量表达载体。将各重组过量表达载体分 别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9，72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号，荧光定量PCR检测结果表明各miRNA 显著过量表达；通过离心收集的各miRNA 重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9 细胞72 h后检测到了更强的红 色荧光蛋白信号，定量 PCR 结果表明各 miRNA 均显著过量表达。将各 miRNA 的重组病毒注射到家蚕 5 龄 1 d 幼虫 体内后，均能显著超量表达相应miRNA，但注射Bac-let-7-C后只有miR-2795显著过量表达，并有明显的组织差 异性，在丝腺中没有过量表达，在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草 地贪夜蛾细胞系 Sf9 和家蚕个体中超量表达了家蚕 let-7 簇 miRNAs，为研究家蚕 let-7 簇和其他 miRNAs 的产生 机制和功能提供了参考。 关键词：家蚕；微小RNA；let-7簇；杆状病毒表达系统；过量表达 Bac-to-Bac Ba