绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性.pdfVIP

中国农业科学 20 13,46(17):3587-3593 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.17.007 绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1 基因原核表达、 纯化与酶学特性 谭永安，肖留斌，孙 洋，柏立新 （江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014 ） 摘要：【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上，以获得具有酶活性的重组蛋 白，明确酶促反应的最佳pH 值及最适温度，为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方 法】将含有绿盲蝽 ALTre-1 基因的 T 载体经 Nde I 和 Not I 双酶切，构建 ALTre-1 基因原核表达载体 （pET28a-ALTre-1），表达载体经诱导表达和蛋白纯化，获得ALTre-1 功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg·mL-1 的条件下，以海藻糖为底物，对纯化得到的重组Tre-1 蛋白进行活性检测，确定其酶促反应的最佳pH 值和最佳温 度。【结果】ALTre-1 基因在大肠杆菌中 BL21 中能够高效表达，纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻 -1 -1 糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol·μg ·min ）。重组ALTre-1 蛋白活性最适pH 值为7.0 （酶活性为（202.04 -1 -1 ±13.76）nmol·μg ·min ），表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶，同时重组ALTre-1 -1 -1 蛋白酶活性最适温度为55℃ （酶活性为（228.59±4.62）nmol·μg ·min ）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1 全 长基因，获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白，该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。 关键词：绿盲蝽；水溶性海藻糖酶；原核表达；酶学特性 Prokaryotic Expression, Purification and Functional Activity Assay in vitro of Soluble Trehalse from Apolygus lucorum TAN Yong-an, XIAO Liu-bin, SUN Yang, BAI Li-xin (Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014 ) Abstract: 【Objective 】 The aims of this study are to obtain recombinant protein which has a trehalase enzyme activity and identify the best pH and the optimum temperature on the basis of cloned the soluble trehalase from Apolygus lucorum previous. This research expected to reveal the molecular mechanism of trehalase synthesis and offer the basic research of the development