坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(21):4492-4500 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.21.018 坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立 于春梅，刁有祥，唐 熠，崔京腾，高绪慧，张 颖，鞠小军，武利利 （山东农业大学动物科技学院 山东泰安 271018 ） 摘要： 【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦 布苏病毒 NS5、E 基因分别设计了 1 对特异性引物，同时设计 1 对扩增内参基因β-actin 引物，将 PCR 扩增的片 段分别连接到 pMD18-T 载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，倍比稀释作为质控样品，用于实时荧光定量 PCR 中 NS5、E 基因及内参基因β-actin 标准曲线的构建，并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】 结果显示标准曲线线性关系R2 值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA；特异性结果表明只能检 测到坦布苏病毒的扩增曲线；批内和批间重复性试验的变异系数均小于 0.5%；用已建立的方法对临床样品进行 3 次重复检测，病毒 RNA 的检出率为 100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒 NS5、E 基因的 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR的方法，为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。 关键词：坦布苏病毒；NS5基因；E基因；SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR；相对定量 Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection of Tembusu Virus YU Chun-mei, DIAO You-xiang, TANG Yi, CUI Jing-teng, GAO Xu-hui, ZHANG Ying, JU Xiao-jun, WU Li-li (College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong) Abstract: 【Objective 】The objective of the study is to establish a method for detecting Tembusu virus by SYBR Green Ⅰ relative fluorescence quantitative RT-PCR. 【Method 】 Special primers based on Tembusu virus NS5 and E gene were designed and a pair of primers of house-keeping gene β-actin was chosen. Then these amplified fragments were cloned into pMD18-T. Using the plasmids NS5-pMD18-T, E-pMD18-T and β-actin-pMD18-T as standard products, a real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was performed to construct the standard curves of NS5, E and β-actin gene and detect the sensitivity, specificity and repeatability. 【Result 】 The resu