桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(10):1971-1981 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.10.010 桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析 1,2 1 1 2 1 孙丽娜 ，张怀江 ，闫文涛 ，马春森 ，仇贵生 1 2 （中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城 125100 ； 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 ） 摘要：【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR）是目前所知的最大的离 子通道蛋白，该受体可控制细胞内Ca2+ 2+ 的释放，对细胞内Ca 的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受 体基因（CsRyR ）全长序列，进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】 通过同源序列比对的方法，利用 cDNA 末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长 cDNA 序列；应用生物信息学 软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析，并基于最大似然法构建该基 因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树，明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA，以GAPDH 为内参基因，应用RT-qPCR 技术，解析 CsRyR 在桃小食心虫各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）的表达模式。【结 果】桃小食心虫 CsRyR 的 cDNA 全序列长度为 15 766 bp，开放阅读框 15 405 bp，编码 5 134 个氨基酸。氨基酸 序列比对结果显示，CsRyR与脊椎动物RyRs的一致度分别为45%—47%；与秀丽隐杆线虫（ Caenorhabditis elegans ） RyR 的一致度也为 46%。在昆虫 RyRs 中，与鳞翅目一致度为 91%—94%，与同翅目、双翅目昆虫一致度均为 79%。 系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫 RyRs 亲缘关系最近。结构域分析结果显示， CsRyR 具有 RyR 的典型结构域，如位于 C-末端的 6 个跨膜结构域（AA 4 467-5 029）、释放 Ca2+ 的通道形成基序 GVRAGGGIGD、Ca2+结合位点EF-hand和3 个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290 （BmRyR），AA 4 610-4 655（DmRyR）和 4 946G（PxRyR）在 CsRyR 中无特殊性。此外，CsRyR 中存在 AA 2 490- 2 496 TQAPRPG 和 5 131-5 134 SQAK 两个基序，在其他物种中均没有发现。RT-qPCR 分析结果表明，CsRyR 在蛹 期表达量最高，分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。 【结论】克隆了 CsRyR 基因全长cDNA序列，证明其表达具有发育阶段特异性。 关键词：桃小食心虫；鱼尼丁受体；基因克隆；发育阶段；表达模式 Molecular Cloning and Expression Profiling of a Ryanodine Receptor Gene in the Peach Fruit Moth