小鼠胚胎诱导型Hsp70基因的RNA干扰有效序列筛选.pdfVIP

中国农业科学 2008,41(9):2902-2908 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.09.045 小鼠胚胎诱导型Hsp70基因的RNA干扰有效序列筛选 王明志，田文儒，姜同泉，任登良，田中杰，屈平平，曹荣峰 （青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109 ） 摘要：【目的】应用RNA干扰技术沉默小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）中诱导型 热休克蛋白 70（Hsp72）基因的表达，从而筛选出对 Hsp72 基因具有确实干扰作用的 siRNA。【方法】设计并合成 4对特异性针对Hsp72基因的siRNA，借助LipofectamineTM 2000瞬时转染MEF，41℃热应激处理后，采用RT-PCR 和 Western blot 检测 Hsp70 mRNA 和 Hsp70 蛋白表达量。【结果】在热应激组中，siRNA1、siRNA2 两组及阳性、 阴性和空白3 个对照组的Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量均极显著高于常温对照组（ P ＜0.01），siRNA3 和siRNA4 两组的 Hsp70 mRNA 的表达量极显著低于常温对照组（P ＜0.01）；siRNA3 组 Hsp70 蛋白表达量极显著低于常温对 照组（P ＜0.01），而siRNA 4 组与常温对照组差异不显著（P ＞0.05）。与空白对照相比，4对siRNA 中siRNA3和 siRNA4对MEF 中Hsp72 mRNA 有极显著（P ＜0.01）的抑制作用，其对Hsp72 mRNA的抑制率分别为86.2%和75.4% （ P ＜0.01），对 Hsp72 蛋白表达的抑制率分别为 77.3%和 57.0%（P ＜0.01）。【结论】体外合成的四对特异性针对 Hsp72基因的siRNA中，靶位点在Hsp72 mRNA二级结构表面位置的siRNA3 和siRNA4对Hsp72基因具有显著的抑 制作用，靶位点在Hsp72 mRNA二级结构复杂处的siRNA1和 siRNA2对Hsp72基因的抑制作用不明显。 关键词：RNA干扰；小鼠胚胎成纤维细胞；小干扰RNA Ascertainment of Effective RNAi Sequences of Mouse Embryonic Induced Heat Shock Protein70 WANG Ming-zhi, TIAN Wen-ru, JIANG Tong-quan, REN Deng-liang, TIAN Zhong-jie, QU Ping-ping, CAO Rong-feng (Department of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong) Abstract: 【Objective 】The RNAi method was used to inhibit the expression of induced Hsp72 in the mouse embryonic fibroblast (MEF) to ascertain an effective siRNA of Hsp72. 【Method 】Four pairs of siRNA specific for Hsp72 gene were designed for RNAi and were transferred into MEF thr