口蹄疫病毒干扰na转基因小鼠模型的构建.pdfVIP

摘 要 旦数!口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物急性、高度传播性疾病，由于口蹄疫 病毒存在7个血清型和70多个亚型，各型间不存在交叉保护作用，所以用疫苗和传统 的自然育种方法很难控制此病。而且此病近年来在无口蹄疫国家的爆发给发病国和邻近 国家造成巨大的经济损失。因此，研究并发展新的抗病毒方法以控制口蹄疫是非常必要 性的转录后的基因表达沉默现象，RNAi对基因表达的调控、病毒感染的防护、基因转 座的控制等都具有重要的意义。RNAi从发现开始就受到病毒学研究者的高度重视，被认 为是抗病毒感染最有效的方法之～。许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制 的干扰研究，并取得了良好的进展。为了发展控制口蹄疫的新方法，本研究对口蹄疫病 毒的体内外复制进行了RNA干扰的探索，在此基础上，构建了靶向口蹄疫病毒的siRNA 的转基因小鼠模型，并对所得的转基因鼠进行抗病毒的评价。为RNAi应用于口蹄疫病 毒的基因功能研究以及口蹄疫的防治积累了必要的实验数据，为动物的抗病育种提供一 条新的思路。 、 5．1一HI 的靶位点。根据siRNA表达载体pSilencerRetro对插入序列的要求，设计合 粒注射乳鼠后用5LD50和20 对细胞水平病毒繁殖有一定效果的基础上，利用显微注射法构建了靶向口蹄疫病毒2B、 直接皮下接种0．5ml100LD50AsiaI FMDV口蹄疫病毒，72h后小鼠经眼眶放血处死， 及时取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏制备常规病理切片，同时观察病变。用免疫组 织化学染色法来评价转基因小鼠对口蹄疫病毒的抵抗作用。 缱墨!经酶切和序列测定，正确构建了靶向FMDV的siRNA表达载体，分别命名为： 现，与对照组相比，实验组细胞出现细胞病变现象的程度要轻；不同时间段收集的细胞 上清液测得的TCID∞值比对照有一定程度的降低。注射重组质粒后对小鼠攻毒可使小鼠 模型发病率降低，小鼠的死亡数减少。 在以上基础上将上述两个包含有整个表达框的siRNA片段经显微注射法构建了转基 亲代小鼠与正常异性健康小鼠交配后，其后代鼠经PCR检测，有20％一30％遗传获得转基 因；转基因小鼠之间进行交配后，100％的后代鼠遗传获得转基因。目前，FMD2基因传代 表未见任何异常。 对F1代成年鼠直接感染口蹄疫病毒，感染后的转基因小鼠取组织制备石蜡切片， 与正常小鼠感染后的组织切片比较病理变化的程度；同时对切片进行免疫组织化学染 色，检测转基因小鼠体内表达的siRNA对病毒复制的抑制效果。结果表明：与对照相比， 转基因小鼠攻毒后各组织器官病变轻微；其中，脾脏的脾小体明显增大，显示转基因小 鼠体内细胞免疫功能加强；免疫组织化学结果显示，在对照组小鼠的脾脏、肝脏和。肾脏 中有病毒粒子的存在。而在转基因小鼠，只在脾脏和肝脏中可见少量的阳性病毒粒子。 结论：以上结果表明设计的siRNA在细胞水平上和个体水平上都对口蹄疫病毒复制有一 定的抑制效果；为大家畜的抗病育种提供了一个思路。 羞毽逦!口蹄疫病毒； RNA干扰；抑制；转基因小鼠 Ⅱ Abstract ect：Foot—and-mouth isfoot-and·mouthdiseasevirus etiologicalagent ．Obj disease(FMD)，whose an in animals．FMDVhas7 acuteand disease cloven-hoofed contagiousoccurring (FMDV)，is hi曲ly andover70 totheabsenceof aUthe serotypes subtypes．Owing reciprocalprotectionamon