放牧羔羊矿物质素消化代谢变化规律的研究.pdf

中文摘要 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV 组成型蛋白质谱分析和4 种ORF 的基因分析 中文摘要 斜纹夜蛾(Spodoptera litura, Spli)属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性农业和林业害 虫，主要危害甘蓝、白菜、藕、芋、蕹菜、苋菜、马铃薯、茄子、辣椒、番茄、 豆类、瓜类以及葱韭等。由于斜纹夜蛾的食性杂、世代重叠、抗性强，因此防治 难度高。在各种化学合成杀虫剂严重污染环境，害虫对化学合成杀虫剂抗性日益 增强的情况下，生物防治越显重要和迫切。从自然界中寻找和筛选新的高毒力的 病毒株系是开发 NPV 生物杀虫剂的重要途径。SpltMNPV Ⅱ是一种繁殖率和毒力 极强的新的病毒变异株。该病毒株的基因组全序列已经测定完成。但病毒 BV 和 ODV 的组成蛋白并不清楚，论文对SpltMNPV ⅡBV 和ODV 进行了质谱分析，确 定了BV 和ODV 蛋白组成，并对组成蛋白基因的中的ORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 进行了启动子活性分析，转录时相和表达时相分析，对 ORF57 基因的部 分功能进行了鉴定。 主要研究结果与发现： 1.用二级质谱分析方法对SpltMNPV Ⅱ BV 和ODV 的组成蛋白进行了研究， 确定了SpltMNPV Ⅱ BV 由42 种蛋白组成，通过与已知杆状病毒同源基因的比较， 确定了其中26 种蛋白基因的部分功能；SpltMNPV Ⅱ ODV 由46 种蛋白组成，与 已知杆状病毒同源基因的比较，确定了其中24 种蛋白基因的部分功能。 2.对 SpltMNPV ⅡORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 基因结构进行了分析。 ORF6 基因全长1509 bp，编码502 aa，预测蛋白分子量为55.0 kDa 。该基因既有 早期启动子基序CAGT ，又有晚期启动子基序ATAAG ，推测该基因可能是一个在 病毒生命周期中早晚期都表达的基因；ORF13 基因读码框全长333 bp，编码110 aa， 理论预测蛋白分子量为12.2 kDa。起始密码子ATG 上游发现有一个TATA box 和 杆状病毒晚期启动子基序ATAAG ，没有发现明显的早期启动子基序；ORF57 基因 全长1098 bp，编码365 aa，预测蛋白分子量为42.6 kDa 。起始密码子ATG 上游发 现有一个TATA box ，在起始密码子上游没有发现明显的早期和晚期启动子基序； ORF146 基因涵盖了1383 bp 的读码框，编码460 aa ，理论预测蛋白分子量为50.2 kDa 。该基因起始密码子 ATG 上游发现有一个 TATA box ，一个晚期启动子基序 II 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV 组成型蛋白质谱分析和4 种ORF 的基因分析 中文摘要 ATAAG 。 3.对SpltMNPV Ⅱ ORF6 、ORF13、ORF57 和ORF146 基因的启动子活性和转 录时相进行了分析。发现这 4 个基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有转录的 基因。其中ORF13 和ORF146 基因能被 SpltMNPV Ⅱ病毒编码的反式作用因子所 激活，在感染后期能提高转录水平。而ORF6 基因也能被SpltMNPV Ⅱ病毒编码的 反式作用因子所激活，但是为负调控，在感染后期转录水平有明显下降。 4.对SpltMNPV Ⅱ ORF6 、ORF13 和ORF146 基因的部分序列进行了原核表达， 表达产物经纯化和质谱鉴定后，免疫豚鼠制作了多克隆抗体。抗体效价用 ELISA 进行测定，3 个基因的表达产物制作的抗体效价都在1：2500 以上。 5. 以制备的多克隆抗体为一抗，对SpltMNPV Ⅱ ORF6 、ORF13 和ORF146 基 因在宿主细胞的表达产物进行了表达时相分析。0RF6 基因产物最早在病毒感染细 胞后8 h 出现，0RF146 基因产物最早在病毒感染细胞后4 h 出现，并且后期都有 表达，说明这两个基因都是早期和晚期均表达的基因，与它们的启动子分析和转 录时相分析结果一致。而ORF13 最早在出现病毒感染细胞后12 h，并一直持续到 后期，说明 ORF13 为晚期表达基因。但是 ORF13