扁蓿豆抗寒相关因的克隆与表达分析.pdf

摘 要 深入挖掘苜蓿属牧草的抗寒基因资源，揭示其抗寒机理，为苜蓿属牧草的抗寒育 种研究提供理论依据。以该属抗寒性较强的直立型扁蓿豆为材料，低温冷诱导 3-5 叶期幼苗，利用 cDNA-AFLP 和 RT-PCR 同源序列克隆技术，筛选克隆扁蓿豆抗寒相 关基因，进一步通过荧光定量 PCR 技术和生理生化指标测定，分析扁蓿豆抗寒相关 基因与其他植物抗寒基因的差异、表达时期及基因表达与生理生化指标间的相关性等 表达特性，为明确其抗寒机理奠定基础。主要研究结果如下： 1．直立型扁蓿豆幼苗的叶、茎、根对低温有不同程度的响应，可溶性糖含量和 POD 活性最先在根中提高，最高水平量是对照可溶性糖和 POD 活性量的 3.64 和 1.64 倍；可溶性蛋白和 SOD 活性最先在叶中提高，最高水平量是对照可溶性蛋白和 SOD 活性量的 1.52 和 2.12 倍。可溶性蛋白、SOD 酶活性和 POD 酶活性间存在显著相关 性，说明扁蓿豆在低温胁迫条件下提高渗透物质含量和抗氧化物酶活性来抵御寒冷。 2 ．通过 RT-PCR 技术同源克隆得到扁蓿豆 Actin 、CAS15A 和 CAS15B 基因，与 苜蓿的Actin 和 CAS 基因相似率高达 93% 以上。其中扁蓿豆Actin 基因在不同温度处 理下的叶、茎、根中表达均无差异，可作为后期定量分析的内参基因；扁蓿豆 CAS 基因的核苷酸序列含有 CRT/DRE （TACCGACCA ）低温应答元件，同时氨基酸序列 具有与其他植物 CAS 基因相似的 4 个相关位点、4 次重复的 10 肽序列的低温相关位 点和序列；扁蓿豆 CAS15 基因属于 CAS 冷诱导基因家族，随着低温胁迫时间的延长 表达量呈现上升趋势，并在冷处理 72h 和 84h 达到相关表达量最高水平，推测 CAS15 的表达增强了扁蓿豆的抗寒性。 3 ．采用 EcoR Ⅰ和 Mse Ⅰ为限制性内切酶建立扁蓿豆的 cDNA-AFLP 反应体系， 用于扁蓿豆低温诱导基因差异表达的研究。选取其中 58 条上调表达的差异片段进行 功能预测，主要参与光合作用、呼吸反应、细胞信号转导、物质代谢、防御反应等生 理过程，其中 70.79% 的差异片段序列与蒺藜苜蓿的相关序列高度一致。通过qRT-PCR 对其中 7 个有特点的基因进行量化分析证实均参与低温调控。 4 ．利用 RACE 技术获得扁蓿豆抗寒相关的 MRPP2C 、MRHSP70 、MRHLH 的 cDNA，其编码蛋白分别具有 PP2C 、HSP70 、HLH 的保守域，与蒺藜苜蓿及其他植 物的相应基因编码氨基酸序列具有很高相似度。在低温处理 84h 内，3 个基因在扁蓿 豆幼苗中的表达量变化趋势相似，均出现了2 个峰值。其中MRHLH 与MRCAS15 基 因表达量呈显著正相关，SOD 酶活性也与抗寒相关基因 MRHLH 、MRCAS15A 、 MRCAS15B 呈显著正相关。通过分子水平和生理水平抗寒研究，说明扁蓿豆抗寒能力 是一个复杂的调控网络。 关键词：扁蓿豆；低温；cDNA-AFLP ；RT-PCR；差异表达；生理 Cloning and Expression Analysis of the Cold Resistance Related Genes of Medicago ruthenica Abstract Digging deep into cold resistance genes of Medicago and revealing the mechanism can provide theoretical basis for cold resistance breeding on Medicago . In this paper, Medicago ruthenica which has strong cold resistance were taken as materials. cDNA-AFLP