鸭肠炎病毒糖蛋b单克隆抗体的制备与鉴定.pdf

摘 要 摘 要 鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis ，DVE ），又名鸭瘟（Duck plague ，DP ），是由鸭肠炎 病毒（Duck Enteritis Virus ，DEV ）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血 性传染病。我国动物防疫法将鸭瘟列为三类疫病，是当前危害我国养禽业发展的主要疫病之 一，其特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高。鸭肠炎病毒被划分为疱疹病毒科未 分属，直径160~180 nm，基因组大小约为150 Kb，由共价连接的独特长区（UL ）和独特短 区（US ）组成，糖蛋白B 由ul27 基因编码，ORF 全长3003 bp，含1000 个氨基酸残基，分 子量为113.7 KDa。在所有的疱疹病毒中gB 是病毒复制的必需糖蛋白，在病毒吸附、穿入和 介导细胞间融合中发挥重要作用，同时 gB 也是宿主免疫反应的主要靶抗原，能诱导细胞免 疫、刺激机体产生中和抗体和细胞毒T 淋巴细胞反应。鸭肠炎病毒gB 的功能仍不为人所知， 而且鸭肠炎病毒gB 的单克隆抗体还未见报道。 本实验构建鸭肠炎病毒糖蛋白B （DEV-gB ）真核表达载体pcDNA3.1-DEV-ul27 ，以其为 免疫抗原，联合盐酸布比卡因免疫BALB/c 小鼠，建立筛选抗DEV-gB 蛋白单克隆抗体的间 接免疫荧光检测方法。分离免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，采用平均分布细胞法， 经过3~4 次克隆，最终共获得13 株分泌单克隆抗体（McAb ）的杂交瘤细胞，分别命名为2G7 、 3D7、5G5、6A6、6D1、6E10、8A2、9B8、9F4、10H2、11A5、11B4 和12G9。染色体数目 介于92~110 条之间，分泌单抗的亚类均为IgM 型，轻链均为κ链。杂交瘤细胞经鉴定可在 体外长期培养，并能持续、稳定的分泌抗体。 利用Western blot 实验对13 株单克隆抗体识别的抗原肽段进行初步分析，结果表明2G7 、 6A6、6D1、6E10、8A2、9F4 和11B4 均能特异性识别61~110 aa 肽段；而单抗3D7、5G5、 11A5 和12G9 识别的抗原表位区域位于655~720 aa 肽段。9B8 和10H2 这两株单克隆抗体与 截短表达的蛋白均不发生反应，可能针对的是构象表位。 通过Dot-ELISA 检测单克隆抗体与天然病毒粒子的反应性，结果表明8 株单克隆抗体可 与天然病毒发生反应，分别为：3D7，5G5，6E10，6D1，8A2，9B8 ，10H2 和11B4。 采用微量细胞病变中和实验和空斑减数中和实验检测获得的单克隆抗体的中和活性，结 果表明3D7、6D1、8A2、9B8、11A5 和 12G9 有中和活性，中和3D7 和6D1 的中和效价为 100，其它株为10。 本研究制备了针对鸭肠炎病毒糖蛋白B 的单克隆抗体，并对其进行Western blot 分析、 与病毒的反应性和中和活性和进行了鉴定。把糖蛋白B 进一步截短表达，可以用这些单克隆 抗体对 gB 抗原表位进行分析；根据这些单克隆抗体与截短表达蛋白的反应性可以进一步确 定天然 gB 具体肽段和抗原表位的功能；应用单克隆抗体建立检测方法，如间接免疫荧光和 ELISA 检测病鸭体内的抗体水平。 关键词 鸭肠炎病毒；单克隆抗体；糖蛋白B ；间接免疫荧光；抗原表位 I Abstract Prepartion Monoclonal Antibodies to Glycoprotein B of Duck Enteritis Virus and Identification Abstract Duck virus enteritis(Duck Virus Enteritis, DVE), also known as duck plague(Duck Plague, DP), is caused by duck vir