黄花苜蓿组织培再生体系建立及品质改良转基因研究.pdfVIP

摘 要 苜蓿是重要的豆科牧草，我国苜蓿资源丰富，但可消化率较低，如何提高苜蓿的 可消化率，改良其品质，提高其营养价值，是目前苜蓿育种工作者的主要任务之一， 随着基因工程的发展，分子学手段在苜蓿育种中逐渐应用广泛，使得明确育种目标后 育种进程加快。本试验以呼伦贝尔野生黄花苜蓿（Mcdicago falcata L. ）为材料，对 其建立了无菌苗培养优化体系、组织培养再生体系、农杆菌介导的遗传转化体系，旨 在通过转基因手段获得高含硫氨基酸和低木质素的转基因黄花苜蓿。获得结果如下： 1. 野生黄花苜蓿无菌苗的最佳生长条件是种子经过 75 ﹪酒精预处理70s，0.1 ﹪ HgCl 震荡消毒8min 后，在添加30g·L-1 蔗糖1/4MS 培养基中，发芽率可达91.32 ﹪。 2 研究结果显示，0.1 ﹪HgCl2 消毒时间是无菌苗生长的主要影响因子，蔗糖浓度也有一 定影响。 2. 野生黄花苜蓿再生体系研究结果表明，培养 10d 的野生黄花苜蓿无菌苗下胚 轴和子叶在愈伤诱导培养基MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+ 0.4 mg·L-1 6-BA+3 ﹪蔗糖+0.7 ﹪琼 脂上，愈伤诱导率均可达到100﹪；最佳胚性愈伤形成培养基为MS+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA+2 ﹪蔗糖+0.7 ﹪琼脂，胚性愈伤形成率81.5 ﹪；最佳分化芽形成培养基为 MS +0.25 mg·L-1 KT + 0.05 mg·L-1 NAA+2 ﹪蔗糖+0.7 ﹪琼脂，分化芽形成率36.5 ﹪； 最佳生根培养基为1/2MS + 0.5 mg·L-1 NAA+1.5 ﹪蔗糖+0.7 ﹪琼脂，生根率为93.3 ﹪。 研究结果显示，在同一激素水平上有大约1/3 植株的愈伤状态优于其他植株，这说明 黄花苜蓿材料个体间的组织培养再生性存在较大差异。 3. 建立了根癌农杆菌 LBA4404 介导过表达载体 pDESAK-APR 和干扰载体 p449hct-c3h 共转化野生黄花苜蓿的遗传转化体系。研究结果包括：将两个载体的农 杆菌菌液等体积等浓度混合；两种菌液的OD600 均为为0.4～0.5 ；侵染时间为6～8min； 侵染外植体为黄花苜蓿无菌苗的子叶和下胚轴；共培养时间为 3d ；抗菌素Cef 抑菌 浓度为500mg·L-1 ；选择压Kan 筛选浓度为60mg·L-1 。获得目的基因表达水平转基因 苗。 关键词：黄花苜蓿；再生体系；共转化；pDESAK-APR ；p449hct-c3h Establishment of Tissue Culture Regeneration System and Transgene for Quality Improvement in Medicago falcata L. Abstract Alfalfa was important legume forages, and its resources was very rich in our country, but the digestion rate was low, so how to improve the digestion rate and quality, enhance the nutritional value were the main tasks of workers for the alfalfa breeding. With the development of genetic engineering, molecular method had been used widely of alfalfa breeding, it made breeding process speed up after clearing the breeding targets. In this study, it was as materials that optimization for aseptic culture, tissue culture regeneration system and Agrobacterium-mediated ge