5-氮-2-脱胞苷对牛成纤维细胞周期、染色体和凋亡的影响.pdfVIP

5．氮．2．脱氧胞苷对牛成纤维细胞周期、染色体和凋亡的影响 摘要 核移植效率低是限制体细胞核移植技术应用的主要原因，目前普遍认为，供体 核的不完全表观重编程导致在发育过程中有重要作用的基因异常表达或没有表达 是动物核移植失败的主要原因。DNA甲基化酶抑制剂是目前应用较普遍的一种药 物。然而DNA甲基化酶抑制剂存在一些问题：如核苷类似物的细胞毒性、寡核苷 酸在体内或细胞内作用的稳定性与长期疗效性等。在培养液中添加这种试剂可以诱 发细胞形态变化、细胞中的基因突变、细胞凋亡以及失活X染色体和印记等位基因 的重新活化等，这些都影响了甲基化抑制剂的应用。故本实验针对以上问题设计如 下试验： 1．建立体细胞核移植所需要的供体细胞细胞系，本实验采用荷斯坦奶牛耳组 织块贴壁法获得原代细胞，经过传代培养得到纯化的成纤维细胞。通过细胞冷冻保 存与复苏、细胞生长曲线的绘制及细胞染色体的核型分析等得到了生长旺盛、染色 体变异率低、可以稳定传代的荷斯坦奶牛成纤维细胞系。 种既不影响体细胞生物学特性，又可降低供体细胞细胞核的甲基化状态方法，从而 提供一种提高体细胞核移植效率的方法。实验中用不同浓度的甲基化酶抑制剂 (5-aza-dc)处理奶牛成纤维细胞72h，分别采用流式细胞仪检测细胞周期方法、 常规染色体核型分析方法及琼脂糖凝胶电泳测细胞凋亡法，检测5-aza．dc对细胞周 期、染色体及细胞凋亡的影响。结果显示：经甲基化酶抑制剂5．aza．dc(O．005．0．1 不显著(P0．05)；低浓度的甲基化酶抑制剂(0．005 1．tmol／L和0．01 pmol／L)处理 的细胞，染色体没有发生明显的畸变(尸O．05)，染色体能够保持正常的形态，高 浓度(0．03 1．tmol／L与O．05 高浓度0．1 脂糖凝胶电泳图谱上可见经0．005 gmol／L、O．01 胞与对照组一样都没有出现明显的DNA拖带现象，而从O．03 gmol／L组就开始有拖 带现象，O．05 1．tmol／L和O．1 pmol／L浓度组与对照组相比细胞发生凋亡的比例显著增 加。总之，此实验的结果说明在对供体细胞做甲基化处理时用0．005 gmol／L和O．01 gmol／L的5-aza—de处理不会影响细胞的染色体结构和数目，并且细胞凋亡率很低， 同时不会影响细胞周期，但是高浓度处理则会导致染色体畸变率与细胞凋亡显著增 加，理论上不能用于体细胞克隆动物的生产。 关键词：5．氮．2．脱氧胞苷；奶牛成纤维细胞；细胞周期；染色体；细胞凋亡 ABSTRACT Low of somaticcellnuclear efficiency transferisthemain problerIltolimitthe of thiS appllcatlon itis technology．Now thatthe generallyacceptedmain teasonforthe fallurcofnuclear transferisthe apparent