sod的测定资料.ppt

实验七：SOD的含量测定 一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能 1、超氧化物歧化酶的组成 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）是一种能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类： Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD 自由基：是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是[万病之源]，是人体健康的大敌。 2、超氧化物歧化酶的生理功能 （1）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象 （2）治疗由自由基损伤而诱发的疾病 （3）消除肌肉疲劳 （4）提高人体的抵抗力 蛋白质含量测定方法 定氮法 紫外分光光度法 双缩尿法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） 其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑的几点因素 ① 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ② 蛋白质的性质； ③ 溶液中存在的干扰物质； ④ 测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其 突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、紫外分光光度法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。 二、双缩脲法（Biuret法） 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基（-CONH2）或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为540nm，测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。此复合物将Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20-250mg。 四、考马斯亮兰法（Bradford法） 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与