adv分离株全因序列测定及vp2抗原表位区的表达与应用.pdfVIP

摘要 摘要 水貂阿留申病(Aleutian disease miak 病毒属(Amdovims)水貂阿窘申病毒(Aleutian 理性失调，是一种主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。该病以垂直和水平传播两种 形式在世界各国的貂群中广泛流行，导致没有抗体的新出生幼貂的急性『自J质性肺炎甚至 死亡，成年水貂的繁殖能力、皮张质量、健康状况下降以及死亡率增加，对水貂养殖业 造成不可低估的经济损失。近年来，我国水貂养殖区阿留申病的流行情况在国内时有报 道，高水平的AD感染一直是严重影响我国水貂养殖业高效、健康发展的一个非常重要 的因素之一。由于目前针对该病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通过定期检测，淘 汰患病貂群，从而达到净化种群的目的。因此，在国内进行分离鉴定病毒株及进行分子 生物学特性研究，建立国内适用的血清学诊断方法，将会对今后国内开展水貂阿留申病 的临床诊断、有效防制及进一步的深入研究，提供更多的科学依据。 在本研究中，首先通过CIEP以及本实验室建立的ADVPCR检测方法，对黑龙江 某水貂养殖场发病送检貂以及辽宁某水貂养殖区疑似阿留申病貂进行检测，将经两种方 法检测均为阳性结果的毒株进行PCR扩增产物的序列测定，扶中抽取序列较为保守的 四株病毒与标准对照毒株进行序列比对和同源性分析，与ADV-O相应片段的核酸同源 功鉴定了四株病毒，分别命名为MS．1、DL．1、DL．2和DL．3。 序，将测序结果用DNA Hein DNA序列。用DNA method将实验测得的毒株 Star软件MegAlign程序中的Jotun 与国外病毒参考株的对应核营酸序列进行同源性比较和进化树分析。结果表明，ADV- 实验毒株的同源性较低；四个实验毒株和三个参考毒株被分别划归为两个组，分属于两 W 远的亲缘关系。用DNA method将实验测得的 Star软件MegAlign程序中的Clustal ADV毒株核苷酸序列、ADV参考株序歹|j以及细小病毒其它四个属的代表毒株全序列进 行进化树分析，发现14株病毒共划归为五个相对独立的进化分支，ADV与牛犬细小病 毒作为细小病毒亚科中新增的属，与其它属的成员分属于不同的进化分支，分析结果验 证了ICTv8公布的新分类体系的合理性。 选择VP2蛋白主要抗原表位区相对保守的ADVMS．1毒株作为种毒，分别设计合成 两对引物，用PCR方法扩增其VP2基因中主要抗原表位区的两个片段，分别将其克隆 捅璺 VP2b，经PCR扩增、酶切和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框萨确，成 功地构建了原核表达载体。阳性重组质粒转化宿主菌TBl，用IPTG进行诱导表达，对 表达产物进行SDS．PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段融合蛋白均以包涵体形式 获得了有效表达，表达产物分别占总菌体蛋白的32．7％和37．41％：表达产物的分子质量 下，4h时其表达量达到高峰：Westernblot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识 别。将分离和初步纯化的表达包涵体蛋白作为抗原，对阳性血清进行CIEP检测，验证 其免疫活性，并与标准抗原的CIEP检测结果相比较，二者的符合率达到94．3％。以本 实验获得的重组蛋白作为诊断抗原的特异性、重复性、敏感性均较好，初步建立了临床 诊断方法。 总之，本研究对ADV国内分离毒株进行分离鉴定和全序列测定，为研究国内ADV病 毒株的进化特点和规律提供基础性资料；在国内首次利用原核表达载体成功地对VP2主 要抗原表位区进行表达，并以其为抗原，初步建立了ADV抗体的CIEP检测方法，将为 国内养貂场有效开展阿留申病血清学调查提供有效的技术手段，在貂群的净化中发挥巨 大的作用。 关键词水貂阿留申病毒，全序列测定，遗传变异分析，VP2基因，原核表达