小型猪乳铁蛋白叶基因的克隆与表达.pdf

小型猪乳铁蛋白N 叶基因的克隆与表达 摘 要 乳铁蛋白(Lactoferrin, LF ) 是一种天然活性铁结合糖蛋白，广泛存在于动物 的乳汁、血液、泪液、唾液、汗液、精液、羊水、胰液、胆汁、小肠液等外分泌 液或血浆、中性粒细胞中。其中在乳中的含量最为丰富，特别是在初乳中浓度最 高。LF 是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅参与铁的转运，而且具有 抗微生物、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能。为了深入的了解小型猪乳铁蛋 白N 叶基因的生物学活性和应用发展空间，为该蛋白的以后研究提供基础，进 行了本实验。本实验进行了猪乳铁蛋白的克隆与表达研究，详细内容如下： 试验1：猪乳铁蛋白N 叶基因的克隆与序列分析 本研究采用外科手术取得 泌乳15 d 的小型母猪乳腺组织5 g，通过Trizol 提取其中的RNA ，并通过反转录 方法得到PLF N 叶的cDNA, 以GenBank 上登录的L77887 序列为参考设计了一 对引物进行 PCR 得到了猪乳铁蛋白的 N-端基因(PLF-N) 。克隆得到的基因长度 为1099bp，包含了PLF 上1077 个编码序列。在1094-1096 处设计引物时突变为 TAA 终止密码子，因此，此开放阅读框翻译后的蛋白包含了359 个氨基酸残基。 将此基因克隆入pMD19-T-simple 载体，并进行测序。测序结果与GenBank 上登 录的序列号为AY306198 、EF012241 、L77887 、M81327 、M92089 的猪乳铁蛋白 进行比对，发现本研究中所克隆的 PLF-N 基因序列与其它基因报道基因同源性 高达99 ％，确为猪乳铁蛋白基因。 试验2 ：猪乳铁蛋白N 叶基因的大肠杆菌表达 将连接有测序正确目的DNA 片断的pMD19TS-PLF-N 质粒用EcoR Ⅴ/EcoR Ⅰ双酶切后所得的带有EcoR Ⅴ、 EcoR Ⅰ酶切末端的目的基因片断与用 EcoR Ⅴ/EcoR Ⅰ双酶切 pET-30a(+)原核表 达载体后所得载体大片断用T4 酶进行连接并转化到DH5α感受态细胞，通过酶 切鉴定目的基因与载体的连接正确。将重组体转化大肠杆菌BL21 菌株，经IPTG 诱导后，得到了目的基因的融合表达。分析结果表明，猪乳铁蛋白得到特异性表 达。通过对诱导剂IPTG 浓度的改变和诱导时间的长短进行摸索，得到重组菌体 用TB 营养液培养至OD600 值在0.5 左右，用终浓度为1.0 mM 的IPTG 诱导3 h ， 融合表达蛋白表达效果最好。 试验 3 ：重组表达产物纯化及其生物学活性初步研究 重组表达载体在 30 ℃时，TB 营养液中，用终浓度为1.0 mM 的IPTG 进行诱导3 个小时后，用功率 为60 赫兹，超声波裂解1min，间隔1min，裂解20 次获取包涵体，再进行包涵 体裂解获得变性的目的融合表达蛋白。通过缓慢复性得到有活力的融和表达蛋 白。通过纯化包涵体，可以使目的蛋白占全蛋白的百分比有占全菌的17.6％上升 到占全包涵体蛋白的67.4 ％，基本能够满足进行体外抑菌试验的需要。将粗提的 融合表达蛋白进行体外抑菌实验，结果表明融合表达蛋白有一定的抑菌活性。 关键词：猪乳铁蛋白；乳铁蛋白N 叶；克隆；表达；抗菌活性 Clonging and Expression of Mini Pig Lactoferrin N-lobe Gene Abstract LF (Lactoferrin) is a kind of inartificial glycoprotein linked Fe. It widely exists in outside secretions such as latex, blood, tears, saliva, sweat, semen, hydramnios, pancreatic juice, bile, small intestine liquid, and it is also in blood plasma and neutrophil. There is the most in the latex, especially in