山核桃嫁接成活关基因克隆.pdfVIP

摘要 摘 要 嫁接是一门园艺技术，其成活过程包含细胞脱分化、再分化等重大理论问题。山 核桃嫁接是公认的难题，为了深入探索这一珍贵物种的嫁接分子机理和调控机制，本 选、分离和生物信息学分析，结果表明： 1．利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质，适 用于eDNA．AFLP分析和荧光定量RT-PCR分析。 PCRcDNA 2．利用SMARTTM cDNA，完整性好，满足实验要求。 符合技术要求。酶切片段与人工接头连接后进行预扩，获得相当浓度的200～1000bp 的酶切片段拷贝。 4．选用100对选扩引物进行了选择性扩增。改进选扩程序，采用高温(65℃)退火 结合循环降温方法，获得高浓度的特异性产物。 5．用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染对选扩产物进行差异显示，结果共获得300 多条差异表达片段。经切胶回收、纯化和二次克隆等所得差异片段100多条。共测回 来的序列66条，经Blast比序，除去重复序列17条，结果获得了49条TDFs。 6．选取其中12条基因进行定量RT-PCR验证分析，结果显示，其中八个克隆 translationalinitimionfactoreIF-4A，3-5-exoribonuclease／RNA K1／E32K1 auxin factor1，water 18号未知基因，isolate glycoprotein，putativeresponse max channel(PIPlB)，Glycine 未知基因，beta familyG-protein，cdc20 达结果有差异。本实验cDNA．AFLP的表达谱中的75％得到验证。 7．在49条TDFs中，有20个编码已知功能蛋白，8个编码未知功能蛋白，其余 的21个与未注释的基因组序列相似，或者在核苷酸数据库无同源序列。对20个已知 功能的基因进行功能分析，它们分属于物质运输，代谢和能量，细胞周期，信号转导 山核桃嫁接成活相关基因克隆 等9类，说明山核桃嫁接过程中发生了复杂的代谢变化。根据所获得的差异表达基因， 初步绘制了山核桃嫁接调控关系图，从分子水平上证实了现代嫁接的细胞生物学理 论。 异表达研究，并对其加以改进，成功分离到山核桃嫁接成活相关基因。根据这些差异 片段序列制作探针或转化成相应的分子标记，可以为嫁接成活基因的定位、克隆以及 基因表达特性的研究提供理论依据。 关键词：山核桃，嫁接，基因克隆，eDNA．AFLP，定量RT-PCR Ⅱ ABSTRACT ABSTRACT isa includesthe theoriesinthewhole Graftinggardeningtechnology,it important surviving differentiationandSO without dedifferentiation,cell on．The process．such勰cell problem improved and horticulturearcthe tohinderthe of varietyinability key developmentCarya step cathayensis is to themechnasimof orderto themolecul