btg1基因在腺癌中的生物学功能及其机制的研究.pdf

BTGI基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究 中文摘要 中文摘要 目的： 研究BTGl基因高表达对乳腺癌细胞的生长增殖、凋亡和浸润、转移、和放 射敏感性影响及其相关作用机制，为BTGl作为新的预测乳腺癌发生和转移的新 分子标志物、基因治疗的新靶点和在放射治疗调节中的作用提供临床前的理论基 础和实验依据。 方法： 因cDNA的引物一对，并构建携带人类全长BTGl 达载体； G418的克隆，最后采用RT．PCR和WesternBlot法检测细胞克隆中BTGl的mRNA ： 和蛋白表达水平，并对细胞的遗传稳定性进行鉴定。 3、MTT法检测细胞的增殖活性；流式细胞仪法检测细胞周期分布和磷脂酰丝 氨酸外翻法检测凋亡；Westernblot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白表 达变化。 4、细胞划痕法观察细胞体外迁移能力；Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭 能力；Westernblot检测细胞浸润转移相关蛋白的表达变化。 5、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型，观察BTGl对体内肿瘤组织细 胞生长增殖的影响；用免疫组化法分析Bcl．2表达情况和TUNEL法检测肿瘤组织 凋亡情况。 。 6、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型，观察BTGl在体内对肿瘤组织 血管密度和血管数目，免疫组化法分析肿瘤微血管生成和VEGF表达情况。 7、克隆形成法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞存活分数，分析BTGl基因 对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。 8、流式细胞仪法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞周期分布和凋亡；Western blot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白、DNA损伤修复、参与DSB的非 中文摘要 BTGI基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究 同源末端连接修复途径的相关蛋白的表达变化。 相关基因mRNA水平变化：彗星实验检测DNA损伤和修复情况；免疫荧光原位 10、染色体畸变分析检测接受X射线照射对乳腺癌细胞基因组稳定性的影响。 11、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型，观察接受X射线照射后荷瘤 裸鼠的体重、生存期和肿瘤生长的影响；免疫组化分析肿瘤血管分布、微血管生 成和VEGF表达情况，检测肿瘤浸润转移的情况；免疫组化分析Bcl．2的表达和 TUNLE末端染色法检测肿瘤坏死和凋亡的情况。 结果： ． 1、构建携带有全长BTGl cDNA的pcDNA3真核表达载体，经过基因测序， 证实pcDNA3．BTGl质粒构建成功。 检测BTGl基因的mRNA水平和蛋白水平显现高表达，且遗传性状稳定。 D1、 胞的生长速度减慢，细胞增殖能力降低；高BTGl表达的乳腺癌细胞中Cyclin CyclinB1和CyclinEl蛋白表达水平下降，细胞周期的G0／G1期细胞比例升高。 4、与对照组细胞相比，BTGl高表达的乳腺癌细胞出现凋亡，SubG1峰明显 升高，磷脂酰丝氨酸外翻增多，细胞晚期凋亡明显；而且细胞中抗凋亡蛋白Bcl．2 表达水平降低，促凋亡蛋白Bax和caspase．3表达水平升高。 5、BTGl高表达对乳腺癌荷瘤裸鼠模型体重无明显影响，但与对照组荷瘤裸 低，平均瘤重和平均瘤体积均低，且肿瘤组织内瘤细胞密度减少。BTGl高表达的 肿瘤组织内BTGl蛋白显高表达，但Bcl．2表达水平降低，并有的细胞出现核固缩、 呈碎片状，不规则，大小不一致，即凋亡细胞出现。其它对照组裸鼠的肿瘤组织 内未见凋亡细胞。 6、与对照组细胞相比，转染BTGl基因的乳腺癌细胞划痕实验所产生的间隙 较宽，Transwell侵袭实验穿过基质胶膜到达下层的细胞明显减少。转基因组细胞 胞，而E黏附蛋白表达水平则明显高于对照组细胞。 lI BTGI基因在乳腺癌中的生物学功能及其机制的研究