bfgf和pdf-bb作用内皮祖细胞促进血管形成及相关信号分子的研究.pdf

·中文论著摘要· 关信号分子的研究 莉 再 内皮祖细胞(endothelialcells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞， progenitor 即能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞。自从1997年Asahara等首次从成人外 周血中分离出EPCs，并证实EPCs在生后的生理性和病理性血管新生中发挥重要作 用以来。EPCs介导的缺血组织血管再生(即治疗性血管新生)的研究已取得了较 大的进展。 正常情况下，骨髓中EPCs处于休眠状态，细胞因子可以促进EPCs动员、迁 移和分化并参与新血管形成。 EPCS的多向分化潜能是其最重要的生物学特征， EPCs具体向哪个方向分化及其调控机制是目前研究的热点。以往认为，内皮细胞 和平滑肌细胞来源于不同的前体细胞，但最近Yamashim和Lino等人的研究发现， 内皮细胞和平滑肌细胞可以来自同一前体细胞。而且有人在体内外的血管形成研 究中发现，成熟的内皮细胞可以转分化为血管平滑肌细胞。因此，这些均可为研 究EPCs的平滑肌分化潜能奠定一定的理论基础。 EPCs的分化受多种因素的影响，如缺氧、生长因子等，然后通过复杂的信号 通路调节细胞内多种基因的表达，最终引起EPCs的不同方向分化。血管内皮细 胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)主要通过对内皮细胞的直接丝裂 原作用促进新生血管的形成。PDGF．BB是目前研究其在血管形成和稳定方面比较 的血管缺乏周细胞／平滑肌细胞募集，这也说明PDGF．BB是血管成熟的重要因子。 目前人们就治疗性血管新生进行了广泛的研究，但是许多研究还只是注重新 生血管形成的多少而忽略了新形成血管的成熟性和稳定性。一个成熟、功能血管 网的形成需要内皮细胞和平滑肌细胞的相互作用，因为内皮细胞只能启动血管形 成过程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，则必须要有平滑 肌／周细胞的参与。因此，如果能分离出既能分化为内皮细胞又能分化为平滑肌细 胞潜能的干／祖细胞，同时这种干／祖细胞源性的内皮细胞和平滑肌细胞又具有明显 的增殖、迁移能力，这将为功能血管网的形成奠定雄厚的基础。 内皮祖细胞可以分化为内皮细胞并参与在治疗性血管生成中，这一现象早己 被许多实验所证实。通常生长因子与细胞表面的受体结合后，可以激活其下游分 子而发挥促细胞分化、增殖等作用。磷脂酶C吖(PLC吖)是生长因子信号通路的一 个重要信号中介，可被生长因子酪氨酸受体所激活，细胞外生长因子调节细胞生 长和分化主要通过其受体的酪氨酸激酶被活化而发挥作用的。通常人们认为 PLC-)是一个与细胞增殖和分化有重要关系的分子。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 通路是细胞发挥功能的重要信号转导通路。真核细胞中，已确定出ERK 中JNK和p38MAPK两条通路主要与细胞的应激和凋亡有关，而在细胞信号转导网 络中处于枢纽地位的ERK通路主要与细胞的增殖和分化密切相关。 内皮样细胞和平滑肌样细胞分化并参与成熟功能血管网的形成；同时通过检测这 二种细胞的增殖、迁移和形成血管的能力明确其能否成为新血管形成的种子细胞。 此外，探究bFGF和PDGF．BB介导内皮祖细胞分化、增殖的相关信号分子的表达， 为阐明内皮祖细胞的多向分化机制奠定坚实的理论基础。 实验方法 一、大鼠内皮祖细胞分离、培养及鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集 EPCs。 ， 二、EPCs的诱导培养及形态观察 EPCs被培养5天后。进行分组，对照组仅给20％胎牛血清的DMEM培养 2 培养期间每2．3天换液并补充相应生长因子。每天观察细胞形态变化并采集图像。 三、免疫荧光检测EPCs分化标记物 EPCs在置有玻片的24孔板内被诱导到第4天和第8天时，换无血清培养基 孵育24h后，取出玻片，经4％多聚甲醛固定，5％BSA封闭后加入一抗，40C过夜， 加入FITC、PE和TKITC分别标记的相应二抗，37℃孵育，封片，荧光显微镜 观察、采集图像并进行荧光强度分析。 四、Western Blotting检测EPCs分化相关蛋白表达 取EPCs被诱导到第4天和第8天时的细胞进行检测