b型流感嗜血杆多糖制备工艺及其d蛋白原核可溶性表达研究.pdfVIP

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2016-03-04 发布于贵州
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b型流感嗜血杆多糖制备工艺及其d蛋白原核可溶性表达研究.pdf

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b型流感嗜血杆多糖制备工艺及其d蛋白原核可溶性表达研究

目录摘要……………．．．．．．……………………．……．．…．．．．．．．1 Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 前言……．………………．．．…．．．．………………．．．…．…．4刖五……．………………．．．…．．．．………………．．．…．…．4 1．Hib概况…………………．………………………………．．4 1．1Hib病原学及流行病学………．………………………………．4 1．2Hib多糖免疫机理……………………………………………4 2．Hib结合疫苗………………………………………………．．5 2．1结合方法…………………………………………………．5 2．2结合用载体蛋白……………………………………………．5 2．3中国Hib疫苗应用现状………………………………………．7 3本实验的目的及意义…………………………………………．．7 第一部分b型流感嗜血杆菌的多糖的制备……………………………7 1．材料………………………………………………………7 1．1菌株来源…………………………………………………．7 1．2主要试剂…………………………………………………．7 1．3主要仪器设备………………………………………．……．．8 1．4主要试剂配方……………．．………………………………．9 2．方法………………………………………………………9 2．1种子批制备及检定…………………………………………．．9 2．2Hib菌种的发酵培养………………………………………．．11 2．3多糖制备工艺……………………………………………．．1l 2．4连续三批fOOL发酵中试生产多糖的质量鉴定……………………．．13 3．结果……………………………………………………．19 3．1种子批检定结果……………………………………………19 3．2菌种扩大培养过程中各项鉴定…………………………………20 3．3多糖制备工艺的优化………………………………………．．22 3．4连续三批IOOL发酵中试生产多糖的质量鉴定……………………．．24 4．讨论……………………………………………………．．28 5．小结……………………………………………………．．28 第二部分b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达……………………29 1．实验材料………………一………………………………．29 1．1菌株及质粒………………………………………………．29 1．2试剂……………………………………………………．29 1．3主要器材与仪器……………………………………………29 1．4主要试剂配方……………………………………………．．29 2．方法……………………………………………………．．29 2．2b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增………………………．30 2．3重组表达载体的构建及克隆…………………………………．．3l 2．4D蛋白的原核表达…………………………………………．．34 2．5重组D蛋白的纯化…………………………………………．35 2．6重组D蛋白Westernblot分析………………………………．．35 3．结果……………………………………………………．．36 3．1 36 b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增………………………． 3．2重组表达质粒的鉴定………………………．………………．36 3．3表达产物的SDS—PAGE分析………………………………．…．．39 3．4D蛋白纯化过程中SDS—PAGE分析………………………………．40 3．5重组D蛋白的Westernblot分析……………………………．．．41 4．讨论……………………………………………………．．41 4．1目的蛋白的分析与表达………………………………………4l 4．2表达系统与表达载体的选择…………………………………．．4l 4．3重组D蛋白的表达…………………………………………．42 4．4重组D蛋白的纯化．．………………………………………．．42 4．5本研究的意义……………………．………………………．42 5．小结……………………………………………………．．43 参考文献…………………………．………………………．． 44 附录1缩略语………………