c-di-gm信号通路和rgpac基因调节变形链球菌致龋特性的初步研究.pdf

龋特性的初步研究 博士研究生：谢苗苗 指导教师： 吴补领教授 辅导教师： 闫文娟副教授 摘要 龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一，发病率高，涉及范围广。变形 mutans，S mutans)作为龋病主要的致病菌，拥有复杂的毒 链球菌(Streptococcus 力因子，参与了其在牙面的黏附、聚集、菌斑生物膜的形成、产酸耐酸等作用。 比较基因组学研究发现一类含有GGDEF／EAL结构域的蛋白在各类细菌中 普遍存在，进一步研究发现其功能主要是参与3’．5’环二鸟苷酸(bis．(3’．5’)．cyclic dimeric guanosine 两个GTPs合成c．di．GMP。大部分的GGDEF结构域在临近N端的活性位点处 含有一个I位点，该位点可以与非竞争性抑制产物c．di。GMP结合，这种别构抑 制作用能够限制c．di．GMP的浓度，阻止GTP的过度消耗。磷酸二酯酶 5-pGpG)分子，这些小分子物质不具备生物活性，在细胞内很快被其它的磷酸 二酯酶降解。通常情况下，GGDEF和EAL结构域存在于同～个蛋白的C端， 而负责信号感知及传导的结构域则位于蛋白的N端，可以感知一系列信号，例 如PAS和GAF结构域，涉及到细胞内小分子的结合或者蛋白与蛋白之间的相 互作用。除此之外，还有一小部分GGDEF和EAL结构域蛋白的N端整合在 ——————————————』坚．． 细胞膜上，负责感知信号，但是目前还不清楚这些结构域能够感知什么样的信 丐。 近年来的研究已经证实，c．di．GMP是原核细胞信号转导中一类新的第二信 使，是一种小分子复合物，具有热稳定性，能够激活纤维素合成酶，参与多种 复杂的生理活动的调控。它的作用涉及细菌细胞的分化、生物膜的形成、细胞 间的通讯、毒力因子的表达以及与宿主细胞间相互作用等多个方面，是细菌生 存和代谢过程中的关键性调节因子之一。 研究发现变形链球菌中存在c．di．GMP信号通路，外源性c．di．GMP的加入 和内源性c．di．GMP的丧失均会降低变形链球菌的致龋特性(表现为生物膜形成 量减少)，但其机制尚不清楚。对这些问题进一步的研究将有助于加深对变形链 球菌中c．di．GMP信号途径的作用方式的认识，也为探索新的防龋方法提供了依 据。本课题组在前期研究的基础上，构建了变形链球菌内gcp基因敲除菌株， 以便更全面、深入的探讨变形链球菌内c．di．GMP的作用机制和信号通路，同时 mutan5 与S UAl59野生菌株进行基因芯片比较，筛选和生物膜有关的基因进行 信号通路分析。 本论文包括以下三部分内容： 第一章：变形链球菌gcp基因突变株的构建 UAl59全基因组序列，采用Primer 本实验根据NCBI提供的＆mutans Premier 5．0软件(Premier公司)设计gcp基因的上游引物和下游引物，扩增gcp 基因的上游片段和下游片段。采用双酶切及同源重组的方式构建了含有壮观霉 素抗性(spe)的载体pFW5．gcp．UP—DOWN。在下一步实验中，采用同源重组的方 式构建变形链球菌gcp基因突变菌株。 用限制性内切酶Nhe I酶州EB公司)对载体pFW5一gcp，UP—DOWN进行酶 ug备用。 切，将环状的质粒变为线性化的片段，胶回收酶切后的线性化片段10 取lm1变形链球菌感受态细胞菌液，加入30l线性化的重组载体 博士学位论文 株，命名为gcp．KO。 mu砌ns 通过对转化菌的形态学观察发现，转化菌形态与S UAl59菌基本一 致，但是细菌排列更为稀疏，这可能是由于基因缺陷后引起的生长差异所致。 II双酶切后出现2条带，与质粒pFW5．gcp．UP的大小基本