camp受体蛋调控鼠疫耶尔森氏菌毒力的研究.pdf

巡鐾佳蛋自调撞鼠蕉噩丕蠢医蕉耋左鲍班荭 (：AMP受体蛋白(Cl心)调控鼠疫耶尔森氏菌毒力的研究 中文摘要 鼠疫是一种烈性自然疫源性疾病，人类历史上，曾经发生过3次鼠疫的世界 性大流行。自上世纪90年代以来，鼠疫的发病呈上升趋势，2000年开始，世界 卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。另外，鼠疫菌是传统的生物 性战剂之一，还是恐怖分子制造生物恐怖的首选微生物之一。鼠疫在中国的流行 也很严峻，疫源地约占国土面积的15％，主要分布在我国的西北部，对人们的生 命和财产造成巨大的威胁。 鼠疫的病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)，在自然界，鼠疫的主 要宿主是啮齿动物，主要通过节肢动物蚤的叮咬在宿主之间传播。通过蚤叮咬或 者其它途径，鼠疫可以传染给人，引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。 鼠疫菌从鼠蚤传播到新的宿主过程中，经历了温度，渗透压，离子浓度，PH， 氧等信号的改变，鼠疫菌必须适应相应的环境压力才能存活并维持其毒力和致病 性，而每个适应性反应也必然伴随着鼠疫菌基因转录的改变，这体现在：很多特 定的调控子，分别感应特定的外界信号，介导特定基因(包括毒力基因)表达的 上调和下调，最终组成复杂的毒力调控网络，控制鼠疫菌在媒介和贮存宿主中生 存能力和致病力。 receptor coli cAMP受体蛋白(cAMPprotein,CRP)作为细菌调控子能调控E 的100多个基因，包括参与分解代谢抑制的基因。在本实验中，我们构建了鼠疫 菌201株的crp突变株(Zlcrp)和回复株。通过体内外的毒力表型实验证实了 CRP的毒力调控表型。利用比较芯片表达谱分析生长在TMH．1mMcAMP中的 CRP的基序的特点，用生物 鼠疫菌201株和Acrp的差异表达基因，根据E．coli 信息学的方法预测可能受CRP直接调控的靶基因38个，进一步用实时定量 RT-PCR和EMSA(凝胶阻滞实验)来验证确定CRP的最小调控元。在此基础上， 精细调控机制的研究。通过体内的LacZ报告基因融合实验证明CRP对pta，pst extension 和ypkA有直接调控作用，然后分别用引物延伸实验(Primerassay)和 DNase l I足迹实验(DNasefootprintingassay)确定上述毒力基因启动子区的转录 起始位点，核心启动子元件和CRP结合位点序列，揭示上述基因的启动子区的 结构图。 表型实验显示crp的突变在体内和体外均影响突变株的生长，体外的生长曲 线显示zScrp的倍增时间长于WT，体内实验证明皮下途径感染时突变株的毒力 比相应的野生株下降了15，000多倍，而静脉途径感染时，突变株的毒力大约下 垒△丛￡鐾佳蛋自遢撞鼠瘗韭筮鑫医苴壹左殴硒究 降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必须的，并且在皮下感染途径中更重要。 体内实验证实crp突变株的生长减慢可能是导致两种感染途径中突变株毒力减弱 的部分原因。而相应的回复株能恢复crp缺失株的毒力表型，达到与野生株的毒 力表型一致的水平。先前的实验证明由Pla编码的纤维蛋白酶原激活剂能特异性 的促进鼠疫菌从外周感染部位(皮下感染【跳蚤叮咬]或者吸入)扩散。以上的实 验证据都说明crp突变株中pla的表达缺失除了能降低体内的生长表型外，还能 大大降低该突变株在皮下感染途径中的毒力。 在本实验中，用鼠疫全基因组芯片采用双色荧光的比较芯片表达谱实验分析 生长在TMH-lmMcAlVIP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△c印，筛选出278个差 下调。 汇总E．coli CRP结合序列每个位置四个碱基出现的权重，得到CI冲结合序列的Matrix，进而 利用Matrixscab程序查找278个差异表达基因中的保守CRP基序，找至1J38个与基 序匹配分值高(以8为界值)的基因作为候选可能受CRP直接调控的靶基因。后 子受CRP直接调控，构成了鼠疫菌CRP的最小调控元，其中YP02468的芯片表达谱 结果