hcv 5#9;ncr转基因模型及在反义核酸药物筛选和评价中的应用研究.pdfVIP

HCv 5，NCR转基因模型及在反义核酸药物 筛选和评价中的应用研究 摘要 丙型肝炎是威胁人类健康的重要传染病之一，迄今，尚无有效的疫苗及特异性 抗病毒治疗药物。穗≈乏合适的药物评价模型是抗丙型肝炎病毒药物研究的主要障碍 之一。丙型肝炎病毒(HCV)基因组分子生物学研究进展及反义核酸技术的发展为探 索特异性抗HCV药物提供了一个丌发途径，，本研究致力于竖L…5NC曼丝垄固绁跑与 动物模型的建立，并进行反义核酸药物的丌发研究，以寻找特异性抗HCV药物。因 此，在建立HCV 的生物特性进行了分析，采用HepG2．9706细胞评价了HCV特异性反义寡核苷酸、锤 头型核酶及反义RNA的抑制活性。并用HepG2．9706产生的裸鼠异植瘤模型评价了反 5’NCR转基因小鼠模型的建立。此外， 义寡核苷酸的体内抑制活性，同时进行了HCV 为了增加反义寡核苷酸在病变靶位的有效浓度，对反义寡核苷酸药物的转运体系一 肝靶向pH敏性脂质体进行了研究。 ／ {1什叫5’NBR转基因细胞ttapG2．9706的特性分析 、 我们曾建立了HCV5’NCR调控荧光素酶表达的转基因细胞模型HepG2．9706，为 检测了HepG2．9706细胞中转基因的拷贝数，同时检测了荧光素酶活性，结果显示连 续2年传代培养的HepG2．9706细胞仍具有良好的荧光素酶活性，其细胞中转基因数 有～140拷贝。上述结果表明HepG2．9706细胞株具有较高的转基因整合率，这与其 转基因表达的稳定性相关。提示HepG2．9706细胞株可用于抗HCV反义药物的体外筛 选与评价。 5’NCR基因表达的抑制 2肝细胞靶向pH敏腊质体介导的硫代反义寡核苷酸对HCV 作用 反义寡核苷酸是～种阴离子大分子物质，细胞生物利用度较低且易被细胞溶酶 体酶降解，为了增强反义药物在病变靶细胞内的有效浓度，根掘受体介导的内吞作 用原理，针对肝细胞专一性表达的去唾液酸糖蛋白受体，设计及制备了一种肝靶向 性脂质体，这种脂质体同时具有pH敏感性。采用竞争抑制实验及鸡红细胞溶血实 验分析了其肝细胞靶向性及pH敏感性；应用肝靶向pH敏脂质体作为药物运载工具， 性检测，观察了硫代反义寡核酸对HCV 5’NCR调控功能的抑制活性。结果显示， 不同浓度半乳糖溶液对5％18-·gal脂质体有一定的抑制作用，浓度超过20mmo|／L时， 达到饱合，最大抑制率为38％；溶血实验显示脂质体与红细胞膜融合作用有显著的 pH值依赖性，pH6时。血红素释放量明显增加：肝靶向pH敏性脂质体介导的HCV363 5’NCR调控基因具有显著的剂量依赖性抑制作用，浓度 对HepG2．9706细胞中HCV 为1．Op。mol／L时，抑制率达86％。综上，所制备的脂质体具有一定的肝细胞靶向性 及显著的pH敏感性，这种脂质体能够增强HCV特异性硫代反义寡核苷酸的细胞内 抑制活性，这为针对肝炎病毒的反义寡核苷酸的体内活性评价提供了有用的转运体 系。 5’NCR基因表达的抑制作用 3丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2．9706细胞HCV 核酶是一类在序列特异性识别基础上对靶RNA具有催化切割活性的RNA分 5’NCR及翻译起始区的 子。为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用，根据HCV 二级结构．设计及合成了1个锤头型核酶RzA。将其插入pCI·neo表达载体的多克 隆位点，构建了表达RzA的真核载体。采用转基因细胞模型HepG2．9706细胞，评 5’NCR调控荧光素酶表达的抑制活性。结果表明，在 价了RzA表达载体对HCV HepG2．9706细胞中，RzA表达载体以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基 因的表达，抑制率达80％，提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途 径。 4 HCV特异性反义RNA表达载体的构建及活性评价 反义RNA是反义技术的一个重要领域，