核酸的研究方法-王镜岩生物化学(全)课件.ppt

第16章 核酸的研究方法 第一节  核酸的分离、提纯和定量测定 核酸制备的原则 核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和变性，要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用（在0℃下操作）。 一、DNA的分离 真核生物的DNP(DNA+Pro)溶于水和浓盐溶液(1MNacl),但不溶于生理盐溶液( 0.14MNacl)；而RNP则溶于生理盐溶液，不溶于浓盐溶液，利用此，即可将DNP和 RNP分开。 再利用苯酚或氯仿-异戊醇或SDS+广谱蛋白酶去除蛋白质 一、DNA的分离 浓盐法： 二、RNA的分离 制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。 常用的制备RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA。 （2）分离方法：用异硫氰酸胍／苯酚／氯仿抽提。 （3）分离poly(A)