目的基因(COR)转入细菌细胞的方法和其检测.docVIP

目的基因（COR）转入细菌细胞的方法及其检测 XXX （XXX农业与生物技术学院，XXX XXX， XXX） 摘要：以PGEM-T-easy质粒为载体，将氨苄青霉素抗性基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析。结果表明：氨苄青霉素抗性基因被导入大肠杆菌中并在大肠杆菌中得到表达。 关键字：PCR扩增 氨苄青霉素 抗性基因 大肠杆菌 引言：随着生物科技的飞速发展，越来越多的生物技术被广泛的应用于各类应用领域。如PCR技术、基因重组、DNA连接等等已被人们广泛的应用于生物体内基因的扩增及新的生物性状的研究。然而，对于氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达尚未见研究。本研究借助于PCR、DNA连接转化、琼脂糖凝胶电泳对氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达进行了研究。旨在为氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达提供一定的理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂与器材 1.1.1 材料试剂：大肠杆菌；PGEM-T-easy质粒；Taq酶；引物(正向、反向；10umol/ml)；模板DNA；10×RCRbuffer；ddH2O；dNTP（2.5mol/L）；T4DNAligase；Cacl2（0.1mol/L）；LB培养基；氨苄青霉素（50mg/ml）；溶液Ⅰ（葡萄糖，50mmol/L；Tris-HCl，25mmol/L；EDTA，10 mmol/L）；溶液Ⅱ（0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合）；溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾，60ml；冰醋酸，11.5ml；水，28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）；0.5mol/LEDTA；70%乙醇；氯仿：异戊醇（V:V，24：1）；Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（V:V：V，24：24：1）；琼脂糖。 1.1.2 器材：PCR扩增仪；移液枪；电泳仪；紫外检测仪；恒温摇床；恒温水浴器；恒温培养箱；低温离心机；超净工作台；冰箱；离心管；小指管；酒精灯；牙签；培养皿、试管若干。 1.2 方法 1.2.1 PCR基因扩增 1.2.1.1 加样： 在PCR管中加入ddH2O(35μl)； DNA 样品（1μl）； 10×PCR 缓冲液（5μl） 图1中3泳道为PCR扩增后电泳结果条带，扩增DNA分子量为1000bp左右，这与目的基因相对分子质量相符，达到了目的基因的扩增。 2.2 重组后的质粒导入大肠杆菌后的表达 图2 转化成功的大肠杆菌菌落 图2中的白色菌落为重组后的质粒经转化导入大肠杆菌细胞，在含氨苄青霉素培养基上长出的具有氨苄青霉素抗性的菌落，说明目的基因导入细胞并且得到了表达。 2.3质粒DNA的电泳图谱 图3泳道3和7为本实验电泳泳道，泳道3经电泳后条带较暗淡，其显示出DNA长度大于2000bp，与所预期结果一致；而泳道7经电泳后没有出现条带，分析其原因可能是洗涤DNA过程中，由于移液枪使用不当，连其目的产物一起吸出，致使目的产物流失，而在电泳时没有出现条带。 2.4 质粒酶切产物电泳结果 图4 中泳道3和7为本实验质粒酶切产物电泳结果，有图可以看出，质粒DNA经酶切后隐约的出现了一条大约750bp左右的条带，说明经酶切后，质粒DNA仅有部分被切开，而大多数没有被切开，其长度则显示的是长度大于2000bp的比较清晰的条带。分析其原因一方面可能是由于在进行酶切时酶切的时间太短，另一方面则可能是酶的活性不够高，在一定的时间内无法达到质粒DNA的酶切位点完全被切开的目的。 通过本实验，我们得到了具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌。 参考文献 [ 1 ] 张惟材, 焦迎晖, 袁红杰, 等. 一种新的L-山梨糖脱氢酶基因及其编码的蛋白质. 中国专利, 申请号: 031020607?? [ 2] 山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达 高书颖；张惟材；汪建华；郭蔼光；（微生物学报 第45 卷第 1 期 2005 年2 月） [ 3]大肠杆菌多重耐药调控基因soxS 的克隆及其原核表达 于晓颖, 刘玉堂, 丛薇, 刘树明, 马红霞 (中国兽医学报 2010年10 月 第30卷 第10期) [ 4] ret基因真核表达载体的构建及其瞬时表达 郭小兵 张钦宪 （Journal of Zhengzhou University (Medical Sciences) Sep. 2006 Vo.l 41 No. 5） [5] 韩聪, 张惟材, 游松 大肠杆菌ptsG 基因敲除及其缺陷株生长特性研究（ 生物工程学报, 2004, 20(1) : 16- 20