第9章药物研究的生物化学基础精要.ppt

第一节 生物药物制造的生物化学基础 一、 生物药物制备方法的特点 二、 生物合成技术原理 三、 生物技术原理 基 因 工 程 （GENETIC ENGINEERING） 基因工程技术的定义 用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。 克隆（clone） 指来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被称为副本或拷贝）。获取大量单一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,也称无性繁殖。 细胞克隆、个体克隆、分子克隆 细胞克隆（cell clone） 细胞克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。 个体克隆（Organism cloning ） 个体克隆（Organism cloning）：即是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。克隆在园艺学上是指通过营养生殖产生的单一植株的后代。很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。? 动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。 分子克隆(molecular cloning) 分子克隆（molecular cloning）:指建立单一的重组DNA的无性系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组DNA，通过载体导入受体细胞，使重组DNA在受体细胞中扩增复制，形成单一DNA分子大量拷贝的过程。 克隆技术的应用前景 1.改良动物品种 2.挽救濒临灭绝的物种 3.培植人体皮肤 4.研制名贵药品 5.培育人体器官 目的基因 指要研究或应用的基因，也就是要克隆和表达的基因。 1. 直接从染色体中分离 如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。 2.化学合成法 要求： 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因小 已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。 优点：任意制造和修饰基因，方便设立各种接头及选择偏爱密码子。 缺点：大片段基因获得费时费力，价格贵。 3. 用逆转录酶合成cDNA 以mRNA为模板经RT合成cDNA。然后经过基因克隆，从而获得某种特定的基因。适于高丰度的mRNA。 4. PCR或RT-PCR 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。 以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。 5. 从基因组文库和cDNA文库筛选目的基因 (1)从基因组文库（genomic library）筛选目的基因 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。 从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。 (2) 从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因 将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为 cDNA文库。 (二)基因载体（Vector）的选用 2、载体的分类  功能分类： 克隆载体 表达载体 组成元件的来源分类: 质粒（plasmid）载体 噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体 杂合载体 (如粘粒cosmid) 病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 人工染色体载体 3、克隆载体（cloning vector） （1）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段 （目的基因）的载