超解析度螢光顯微技術簡介n-sim超解析度螢光顯微鏡系統.pdfVIP

超解析度螢光顯微技術簡介 : N-SIM 超解析度螢光顯微鏡系統 Nikon N-SIM Super Resolution Microscope 在生命科學研究領域內，研究學者們無不致力於探討細微的組織架構與單分子物質，而廣 視野螢光顯微鏡長久以來都是學者們研究探討生物樣品及實驗進行的重要工具之一。然而，一般 顯微鏡技術受限於光學繞射極限，其XY 光學解析力僅0.2um 左右。這表示，光學顯微鏡仍無 法分辨小於0.2um 的物體，若研究人員想要觀察的目標物小於0.2um 時，就必須要使用電子顯 微鏡才能分析辨別。不過使用電子顯微鏡對生物樣品而言，卻有必須脫水、塗層甚至抽真空等不 適當的限制步驟 ，因此並不適用於多數的生物樣品或活體細胞 。 如何突破光學極限，以達到清楚觀察細胞結構與分子活動，就成為了學者們所極力探討與研 究的重要議題 。 為有效克服並解決研究學者們的煩惱，Nikon 致力於研發此相關系統六年，並於2009 年底 美國第四十九屆細胞生物年會(The American Society For Cell Biology - 49th Annual Meeting in December 5-9, San Diego) ，正式發表並展示超高解析力光學顯微鏡N-SIN 與N-STORM 系統。 且於2010 年正式於亞洲區推出超解析度螢光顯微鏡系統 。 Nikon 使用獨特的光學科技與製造技術 ，利用享譽全球的Eclipse Ti 研究級倒立顯微鏡並搭 配卓越高解析力的CFI APO TIRF 100x oil 物鏡(N.A. 1.49) ，並以此為基礎再結合由 UCSF(University California, San Francisco 舊金山加州大學)所授權的SIM(Structured Illumination Microscopy)技術，就形成了全新的超解析度螢光顯微鏡系統N-SIM 。此系統非但擁 有高於一般光學技術二倍以上的解像力，甚至還能同時以0.6 秒/幅的時間截取所需之影像，充 分達到生物研究領域活體影像擷取的需求。 關鍵 特 性 1. 超越光學螢光顯微鏡及雷射共軛焦顯微鏡雙倍以上的XYZ 解像力 此系統利用結構式照明顯微技術(Structured Illumination)於顯微鏡光路中架設所需組件，並搭配 Nikon 開發之特殊演算法，運用Moiré effect 的原理 ，將來自兩種不同方向的空間頻率重疊，並將擷取之 影像資訊透過傅立葉運算轉換為原本損失無法觀察的細部空間頻率 ，進而獲得高於原光學系統二倍以上 的光學解析力影像 。 根據實驗結果顯示，無論是傳統螢光顯微鏡或雷射共軛焦顯微鏡均無法與N-SIM 的超解析度相比 擬。測試結果更顯示N-SIM 系統最佳橫向XY 解析度可達85nm ，縱向Z 解析度可達200nm ，實際圖檔 如下圖所示。 2. 0.6 秒/幅高速影像擷取速度 除了提供高解析力影像之外，N-SIM 系統更擁有此類系統中最快的影像擷取速度。在2D-SIM 及 TIRF-SIM 的模式下可達0.6 秒/幅之影像擷取速度，在3D-SIM 的模式下可達1 秒/幅之影像擷取速度， 因此可有效進行活體細胞觀察實驗 ，對廣大的活體細胞觀察實驗而言無非是一大利器。 3. TIRF-SIM 影像技術 新研發的TIRF-SIM 顯微影像技術相較於傳統的TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)提供了更高光學解像力的全內反射螢光觀察，可獲得細胞膜附近更多的細節訊息。N-SIM 無 須擴充及可擁有此影像掃描模式 ，更提供了學者們多重的選擇性及實驗設計構想。 4. 3D-SIM 影像技術 除了2D-SIM 之外，新研發的3D-SIM 顯微影像技術更可對樣品進行光學切片掃描，並可在20um 的 厚度內以更高的光學解像力呈現細胞的更多細部結構影像 ，其包含XYZ 的光學切片影像使研究人員在觀 察探討蛋白間相互位置時能更加精準的判斷結果 。下圖為人類血管內皮細胞於螢光顯微鏡與3D-SIM 模 式下拍攝一層切面的圖檔比較。 本中心有鑑於超高解析度螢光顯微技術的日益成熟，且近年來利用相關儀器所發表的文獻也逐漸增加， 蒐集探討相關應用領域包含有 : Neuroscience (Alzheimer’s disease) Immunology (Regenerative medicines) Developmental Biology (iPS c