人工构建耐热大肠杆菌的分子设计和应用.pdfVIP

Molecular Design and Application of Artificially Constructed Escherichia coli with Heat Resistance A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Engineering By Sun Xiang-ying (Biochemical Engineering) Dissertation Supervisor: Prof. Li Chun June, 2014 万方数据 万方数据 摘 要 工业微生物发酵制造生物基产品的过程中，由于生物代谢热和机械搅拌热致使发酵 体系不断升温，微生物无法自行降到代谢最适温度，需要消耗大量冷却水控温，导致能 耗费用的增加。所以提高发酵菌株的耐热性、拓宽最其适生长温度的范围，将大幅度降 低成本。大肠杆菌作为目前最常用的模式工业微生物之一，提高其耐热性，对获得低成 本生物制品具有重要意义。传统的高温驯化和诱变方法不仅周期长，工作量大，而且效 果不明显，无法满足工业发酵逐渐升温的需求。针对上述问题，本文通过合成生物技术， 基于腾冲嗜热菌 （Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 ）的耐热机制，从分子层面上 设计并构建了耐热大肠杆菌，成功应用于木糖醇的生物转化，为高效、低能耗、低成本 的生物发酵产业提供了新思路。主要研究结果如下： （1）成功克隆了来源于腾冲嗜热菌的18 个耐热基因元件，并构建了对应的18 个耐 热元器件和2 个多功能耐热元器件。热处理下的细胞存活率初步表征了这些元器件对大 肠杆菌耐热性的影响，发现热激蛋白耐热元器件对大肠杆菌耐热性的提高效果最好，类 泛素蛋白和转录因子耐热元器件的耐热效果次之，共筛选出 10 个耐热性较好的基因元 器件用于构建耐热大肠杆菌。 （2 ）以PgapA 启动子作为调控元件，成功构建了10 株组成型表达耐热元器件的大肠 杆菌，可用于高温发酵。梯度升温发酵以及恒定高温发酵对工程菌耐热性能进行了综合 评价，10 株工程菌的耐热性均有不同程度的提高，扩宽了大肠杆菌最适生长温度的范围， 筛选出7 株耐热大肠杆菌用于进一步发酵生产。 （3 ）对耐热大肠杆菌进行了有机溶剂耐受性分析，部分工程菌兼备了多种抗逆性。 在丁醇抗逆性分析中，工程菌BL21-gapA-flia 和BL21-gapA-groes 的耐受性分别提高了 60%和 43% 。1,3-丙二醇抗逆性分析中，工程菌 BL21-gapA-dnak 、BL21-gapA-dnaj 和 BL21-gapA-rpoe7 的耐受性分别提高了 53%、39%和 50% 。工程菌BL21-gapA-groel 的 乙酸耐受性提高了16% 。乙醇耐受性的提高效果不明显。 （4 ）在大肠杆菌体内成功地将耐热元器件与木糖醇转化途径集成。工程菌在40 ℃下 发酵生产木糖醇的结果显示，4 株工程菌BL21-xr-dnak、BL21-xr-dnaj、BL21-xr-thif 和 BL21-xr-flia 的木糖醇产量、生产速率和比生产速率均高于对照组，比生产速率与 37℃ 下的对照相比分别提高了 18.3%、27.7% 、19.6%和26.3% 。同时40 ℃