乳酸乳球菌表达服弓形虫基因疫苗的研究.pdf

乳酸乳球菌表达口服弓形虫基因疫苗的研究 中文摘要 ． 摘 要 ●，}●o} ～ 目的：构建弓形虫昆山分离株和RH株速殖子期表达的基因的完整长度 cDNA文库，从中筛选保护性抗原基因，导入乳酸乳球菌进行表达，制备 弓形虫口服基因疫苗，免疫小鼠，观察其抗攻击感染的保护力。I方法：用 CF．1 1纤维素柱快速提纯速殖子，以盐酸异硫氰酸胍(AGPC)一步法抽 PCR eDNA文库构建试剂盒，构建了弓形虫昆山分离株和RH株的表达型 肠杆菌BL21中进行表达。用亲和层析柱纯化表达产物，并以SDS．PAGE 和Western Ps．P30．T切出，以相同的酶切位点导入大肠杆菌．乳酸乳球菌穿梭表达质 粒L2．PTRK而构建成L2．PsP30T质粒。用BamHI和XhoI从构建好的 L2．PsROPIT。电转化感受态乳酸乳球菌，以Western blotting分别鉴定P30 和ROPl在乳酸乳球菌中的表达。大量发酵制备口服疫苗，并且通过口服 株速殖子攻击感染已经口服法免疫的BALB／c小鼠，观察其抗攻击感染的 保护力，并检测细胞因子IL．4、INF．Y水平的动态变化。结果：1．构建 x106 成弓形虫昆山分离株和国际标准株RH株eDNA文库，分别获得5 x (昆山分离株)和5 105(RH株)个独立克隆，重组率均为99％，插入 片段的平均长度均约为lkb。2．获得弓形虫昆山分离株的P30基因和Rift 基因的447位与448位之间有一96bp的插入片段，另有14个碱基不同， 造成3个氨基酸的改变。两基因之间有91．19％的同源性。3．在大肠杆菌 I 乳酸乳球菌表达口服弓形虫基因疫苗的研究 中文摘要 表达P30基因时得到一分子量为54kDa的融合蛋白，占大肠杆菌总蛋白 的38％。 在大肠杆菌表达ROPl基因时得到一分子量约为71kDa的融 合蛋白。4．P30基因和ROPl基因在乳酸乳球菌中的表达产物中分别有一 约30kDa、43kDa的蛋白带能被弓形虫病人血清识别5．P30组其平均 命7．5天，空质粒对照组为8．5天，生理盐水对照组为8及：与对照组 可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选。2．得了一与Ossorio报道的 基因有较大差异的ROPl基因。 3．分别在大肠杆菌中得到了P30融合蛋 白和ROPl融合蛋白的高效表达。4．在乳酸乳球菌中得到了P30蛋白和 ROPl蛋白的微量表达。5．通过口服法进行乳酸乳球菌活菌表达的弓形虫 基因疫苗免疫是一种有希望的抵抗弓形虫的方法。 关键词： 弓形虫，乳酸乳球菌／口服基因疫彭弓形虫表矮鳓，P30哮l|固 胛嘶即斑啉状粥群n凰呻∥7 隽