人巨细胞病毒感igm抗体捕获elisa方法的建立和应用.pdfVIP

中文摘要 人巨细胞病毒感染IgM抗体 捕获ELISA方法的建立和应用 摘 要 目的：巨细胞病毒(CMV)是一种国际公认的具有严重致 病致畸作用的病原体，其感染孕妇和造成的胎儿畸形和 青春期发育障碍已经成为全球的重大社会问题，其造成 的器官移植失败、导致恶性肿瘤的发生以及与AIDS免 疫抑制密切相关也越来越受到广泛的重视。 ／在目前临床常用CMV感染的病原学检查、免疫学诊 断和病毒核酸检测三大技术中，以检出CMV特异性抗 体为主要目的的免疫学检测技术对CMV感染的早期快 速诊断意义最为重要，其中特异性IgM抗体由于可以进 一步区别CMV的原发或既往感染，并排除母体抗体自 然过继的可能，对判断病变是否为原发或急性感染具有 特殊重要的价值。 采用抗人IgM(u链)McAb包被酶标板，以抗原捕获 与固相抗u链结合的特异性IgM抗体的捕获ELISA方 法，是近年来新近发展起来的免疫学新技术，与目前临 床常用IgM抗体检测的间接荧光抗体技术和间接ELISA 比较，由于排除了类风湿因子、抗核抗体和特异性IgG 的干扰，检测特异性和灵敏度大幅度提高。但是，由于捕 获ELISA方法影响因素较多，试剂条件不易控制，迄今国 内相关成品试剂盒，尤其在CMV感染检测方面尚欠缺。 中文摘要 承德医学院中药研究所和北大未名生物技术诊断试 剂公司已经对相关技术进行了探索，在这些工作基础之 上，为了研究质量可控、方法简便、结果稳定的相关检 测试剂盒，并进行有关科研设计、科研方法的基础训练， 设计本项研究课题。 ’ [方法： l CMV可溶性抗原的制备、纯化和鉴定：主要采用2BS 细胞培养法培养人胚肺纤维母细胞成功后接种CMV．169 毒株，待细胞病变达90％以上后收获细胞，分别采用冻 化方法和甘氨酸法制备可溶性抗原，经盐析法纯化后鉴 定纯化抗原的蛋白质含量；并用意大利Diasorin公司的 CMV抗原作对着比较抗原的效价。 2试剂盒主要工作液的制备：包括对照血清、包被液、封 闭液、标本稀释和洗涤液、底物液、终止液等。 3主要试剂工作条件的选择：方阵滴定和正交试验方法选 择抗u链单抗、对照血清、CMV抗原、酶结合物的使用 _；}口配比条件。 4包被温度的选择：等比稀释的病毒液同时包被三块板， 分别4。C过夜，37℃2h转4℃过夜，37℃烘干处理，方法 ． 同ELISA程序。 5CMV IgM捕获ELISA方法的建立：以意大利Diasorin 公司提供的聚苯乙烯酶标板为固相载体，用一定浓度比 例稀释的待测血清，37℃孵育1小时，洗涤3次拍干， 加入一定浓度的CMV抗原和一定稀释度的酶标记抗体， 37℃孵育30分，洗涤后加入TMB底物作呈色反应。终 止后用酶标仪测定00450。值。光密度值(OD450mn)以阳 中文摘要 性血清孔(P)与阴性血清孔(N)的光密度比值(P／N) 为标准，若P／N／2．1定为阳性，否则为阴性。 6干扰实验：取经I疆检NIgH性的CMV．IgM阳性血清， 分别用I强乳胶和SPA吸收RF因子和IgG后再用上述的 ELISA方法检测OD值。 7试剂盒性能的初步评价：以最佳条件配盒后用聚合酶链 反应(PcR)技术对此方法进行评价，并同时采用通过 国家GMP认证的CMVEIA试剂盒平行检测正常人群、 孕妇的血样作对着；并按国家药品监督管理局《新生物 制品审批办法》规定，分别采用37℃加速实验方法，对 产品进行特异性、灵敏度和精密度检测。 结果： l经紫外分光光度计测定用两种方法制备的CMV可溶性 抗原样品在280rim下的OD值后计算出蛋白质含量分别 u u 为2．38g／ml和2．66eCml。冻化及甘氨酸提取抗原与 意大利Diasorin公司参考抗原检测血清CMV特异性