人脐带血造血干胞的分离和体外扩增.pdfVIP

中文摘要 人脐带血造血干细胞的分离和体外扩增 摘 要 cord blood，UCB) 目的；从人类新鲜脐带ll缸(umbilical stem cell，HSC)；建立含有不 中分离造血干细胞(hemopoietic 同细胞因子的体外培养体系；将收集的UCB单个核细胞 (MNC)在体外培养；掌握体外HSC的扩增方法；采用细胞 活率计数法，形态学观察法，流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测UCB造血细胞表面标志分子变化法，掌握UCB 造血干细胞的生长规律。为建立UCB血库和临床移植治疗一 些成年人恶性病积累必要的实验数据。 方法：采用胎盘娩出后采血法来收集脐带血。需孕妇无 内科、产科合并症及血液系统疾病，操作由助产士协助完成， 无菌采集8份脐血，肝素抗凝终浓度为209l／ml，平均采血量 胞分离液(d=1．077)密度梯度离心UCB，注意保持清楚的界 面，离心2000rpm，30min，用弯头滴管吸取上、中层界面处的白 色云雾层狭窄带(单个核细胞)，用DMEM培养液洗涤两次， 末次离心后，快速弃上清，制成1mlDMEM细胞悬液，细胞活力 染色，有核细胞计数，细胞培养，接种脐血单个核细胞(MNC) 于含体积浓度为20％FCS的DMEM悬浮培养体系中，单个 核细胞终浓度为l×105个／ml，做细胞涂片染色形态学观察， 流式细胞仪检测CD34+细胞含量，于24孔培养板进行细胞培 养，做出6组不同细胞因子组合的细胞培养孔，每组设3个 复孔，以另一不加细胞因子的24孔板为细胞生长对照孔，分 中文摘要 另tlDN入不同组合的干细胞因子(SCF)，Flt．3配基(FL)，粒一 单细胞集落刺激因子(GM．CSF)，自细胞介素一3(IL一3)，白 细胞介素．6(IL一6)，粒细胞集落刺激因子(G—CSF)，血小板 叫：成素(TPO)，于37。C 5％C02浓度下饱和湿度培养2l天， 每次半量换液，吸弃每孔卜清5001．d，避免细胞丢失，每孔所 Ixl细 余5001al细胞悬液，充分吸打，同组每孔分别吸取100 胞悬液，装到lml的导管中，进行细胞计数，涂片细胞形态 学观察，流式细胞仪检测CD34+细胞含量。配制含青霉素、 链霉素、20％FCS、80％DMEM培养液，每孔分别加入600p1 培养液和半量细胞因子，充分混匀，37℃5％C02浓度下饱和 湿度培养。 结果： 体外细胞长期培养，细胞的增殖有明显的不同。 本实验利用Ficoll法收集UCB单个核细胞做体外培养，使用 细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子 的细胞培养孔。6组细胞因子组合分别是 A：SCF+IL．3+IL-6 B：SCF+IL．3+IL-6+GM-CSF C：SCF+IL一3+IL一6+G．CSF D：SCF+IL．3+IL一6+GM-CSF+G—CSF E：SCF+IL．3斗．IL．6+TPO+FL F：SCF+TPO+FL 细胞因子用量分别为SCF 50ng／ml，IL一3 50ng／ml，IL一650ng／ml， GM—CSF 1 40ng／ml，G—CSF 40ng／ml，TPO 0ng／ml，FL40ng／ml， 每次半量换液后，细胞计数显示，活细胞数98％，流式