人骨髓间质干细分离、扩增方法的改良及初步临床应用.pdfVIP

人骨髓间质干细胞分离、扩增方法 的改良及初步临床应用 专 业：免疫学 硕士研究生：刘宇 导 师：李树浓教授 中山大学中山医学院病理生理学教研室 广州(510080) 摘 要 stem cells，MSCs)是骨髓中的一种非造血 骨髓间质干细胞(mensenchymal 干细胞，具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细 胞和神经细胞等。近几年，人们注意到骨髓间质干细胞在造血干细胞移植中的积 极作用。它被认为是骨髓基质细胞的前体细胞，在体外易于传代扩增。由骨髓基 质细胞及细胞外基质组成的造血微环境(hematopoietie 对造血干细胞自我更新及造血分化能力具有明显支持作用。在骨髓损伤后的修复 过程中，或造血干细胞移植后重建造血的各阶段，往往先有造血基质成分的恢复， 而后才有造血的重建。大剂量放、化疗损伤了造血微环境的结构和功能，严重影 响了造血的重建过程。造血微环境的再生和重建是造血恢复的关键与先决条件。 存在于成人骨髓中的间质干细胞(MSCs)是骨髓基质细胞的前体细胞，是组成 造血微环境中重要的细胞成分。它不仅是更新骨髓中基质细胞系的源泉，还同时 分泌一系列造血生长因子促进造血干细胞的归巢、定居和分化，在造血调控和造 血重建机制中占有非常重要地位。大量动物实验和早期临床的安全性研究已经显 示MSCs具有可移植(长期植活、无移植毒性)、支持造血、免疫调节等作用。 因此建立适合临床应用的人骨髓间质干细胞(hMSCs)分离、扩增方法就成 为当务之急。但目前常规培养MScs用的一般是含10％胎牛血清(FCS)的 L-DMEM培养液，但是牛IfⅡ清中可能存在的微生物、牛血清中的异种蛋白在人 体内引起的免疫反应等，这些都可能阻碍了人骨髓问质干细胞(hMSCs)在临床 上的应用，因此如何选择一种安全可靠的方法分离、扩增hMSCs应用于I临床成 为关键。 本实验包括以下二部分： 1、人血清分离和扩增hMSCs，并对其进行鉴定、长期传代后的生物学特性 分析(包括形态特征、细胞表型、增殖能力、分化能力等)。 2、将hMSCs输注到大剂量化疗的白血病患者体内，对其安全性和临床疗效 进行初步探讨。 第一部分 人骨髓间质干细胞的分离和扩增 1、研究目的 本实验拟建立不依赖于胎牛血清的hMSCs的分离、扩增培养方法，尝试利 用人血清、人血清白蛋白及添加不同的细胞因子等方法从成人骨髓中分离、纯化、 培养、扩增hMSCs，为以后将其用于临床奠定基础。 2、研究方法 0％HS的L-DMEM培养 取成人骨髓，Ficoll—Hypaque密度离心法分离，含1 液贴壁培养，3天后逐渐出现贴壁细胞，5．7天全量换液除去未贴壁细胞。此时 可见单个或几个长梭形细胞的克隆，培养至12．15天细胞接近融合。接近融合的 细胞用胰酶室温消化，按1：2比例传代，传代后培养液分别添加细胞因子bFGF、 EGF、LIF，绘制增殖曲线。取第5代的细胞进行流式细胞术(FACS)分析。取第 异丁基．黄嘌呤，100mmol／L吲哚美辛的条件定向诱导贴壁细胞向脂肪细胞分化， 实验组与对照组均行油红O染色。10-7moVL地塞米松，10mmol／L0．甘油磷酸 钠，50ug／ml2-磷酸．抗坏血酸(维生素C)的条件定向诱导贴壁细胞向成骨细胞 分化。实验组与对照组均行茜素红和碱性磷酸酶(AP)染色。通过形态学观察、 流式细胞术ffACS)分析、向成骨、成脂细胞的多向分化潜能鉴定，证实分离到的 细胞是hMscs。最后进行成瘤性实验。 3、研究结果 3．1hMSCs的分离、培养 呈图形，48．72小时后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培养约14—20 天左右可达到80．90％融合。传代细胞24小时内完全贴壁，4-6内达到80—90％ 融合，10例标本均获得贴壁生长，培养液添加细胞因子后可传代至第15-20代。 3．2不同细胞因子对hMSC增殖的影响