人b7h基因原表达载体的构建和表达.pdfVIP

天津医科大学硕士研究生论文 中文摘要 摘要 blood 目的：本实验诱导健康人外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cell(s)，PBMC)分化为树突状细胞(dendritic cell，DC)，然 中进行B7h重组蛋白表达。重组B7h蛋白对研究ICOS／BTh途径在体内信号传导中 的作用具有重要的意义，并为下一步制备B7h单克隆抗体奠定实验基础。 方法： 1．用人淋巴细胞分层液从健康人外周血白膜中分离出PBMC，然后给予IL_2、 逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)法从人Dc中扩增出B7h基因。 酶切鉴定和DNA测序。 3．将测序正确的pTZ57R／T—B7h用NotI／EcoR I双酶切，将所得B7h片段与同 样经NotI／EcoR I双酶切的原核表达载体pGEX一4T-1连接，转化E．co／／DH5a， 构建pG既一4T一1一B7h重组质粒。随机挑选白色菌落，抽提质粒进行PCR鉴定、 烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和免疫印迹(WesternBlot)鉴定。 结果： 1．将人Dc细胞中B7h基因的PER扩增产物进行1．2％琼脂糖凝胶电泳，产物为 单一、清晰条带，大小约为909bp。 天津医科大学硕士研究生论文 中文摘要 列分析。PCR鉴定和酶切鉴定都表明B7h 个重组质粒测序结果相同，且与文献报道的B7h基因序列有99．6％一致性， 证实pTZ57R／T—B7h和pGEX-4T一1一B7h重组质粒构建成功。 coli 3．将重组质粒pGEX一4T-1一B7h转化入EBL21(DE3)，表达产物在SDS—PAGE 上表现为相对分子质量(Relativemolecular IBaSS，Mr)约为56kD左右的 融合蛋白，与预期的结果相符。在Western Blot实验中，与抗人B7h单克 隆抗体反应，出现特异性条带，更进一步确定了B7h重组蛋白的表达。 结论： 1．本实验克隆的基因为人B7h基因。 2．重组质粒pGEX一4T一1一B7h是具有表达功能的原核表达系统。 3．pGEX-4T-1-B7h转化E．cofiBL21(DE3)，其表达产物是B7h融合蛋白。 关键词：树突状细胞；共刺激信号；B7h基因；TA克隆：基因重组；原核 表达；融合蛋白 II 天津医科大学硕士研究生论文 英文摘要 ABSTRACT Toconstruct vector humanBTh Ob|ective prokaryoficexpressioncarrying gene and itinE．coli thattherecombinantB7h is express BL21(DE3)in proteinvery criticaltothe onthe study functionofICOS／B7h andtothe of pathway