人cd160基转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制.pdfVIP

人CD160 基因转染细胞的构建及其单克隆抗体的研制 中文摘要 中文摘要 CD160 分子是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，是免疫超家族成员，与其特异性配 体HVEM 分子结合所提供的共刺激信号在T 细胞的增殖，活化，细胞因子产生和 B 细胞增殖，活化，分泌抗体产生等方面发挥着重要的调节作用。CD160 分子作 为一个负向抑制信号，参与众多免疫过程。建立L929/CD160 基因转染细胞株和鼠 抗人CD160 单克隆抗体的研制能够为进一步开展对CD160 在机体免疫应答中的生 物学效应的研究以及与其他共刺激信号之间的复杂网络关系提供工具，进而深入 探讨和分析临床相关疾病诊断，以及有效治疗提供了可靠手段。 第一部分 人CD160 基因克隆及其基因转染细胞株的建立 【目的】构建稳定表达人CD160基因转染细胞株。 【方法】通过RT-PCR获得人CD160全长cDNA，然后以cDNA进行目的基因的 大量扩增，并将插入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。经测序正确后，通过脂质体 法将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD160 和辅助病毒载体共转染包装细胞 293T ，收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清，用以感染L929细 胞；采用Zeocin筛选，并通过流式细胞术与RT-PCR 的方法反复鉴定，成功获得具 有Zeocin抗性且细胞膜表面能稳定表达CD160分子的基因转染细胞CD160/L929 。 【结果】成功克隆人CD160全长cDNA，并成功构建稳定表达人CD160的基因 转染细胞株L929/CD160 。 【结论】本研究成功构建了稳定表达人CD160的基因转染细胞株，为研制鼠抗 人CD160单克隆抗体和研究CD160生物学功能奠定了基础。 第二部分 鼠抗人CD160单克隆抗体的研制 【目的】研制鼠抗人CD160单克隆抗体。 Ⅰ 中文摘要 人CD160 基因转染细胞的构建及其单克隆抗体的研制 【方法】以稳定表达人CD160的基因转染细胞株L929/CD160为免疫原，免疫 6~8周龄的BALB/c小鼠；采用经典的B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细 胞与骨髓瘤细胞SP2/0 进行细胞融合，并于HAT 选择性培养基中培养；以 L929/CD160作为阳性筛选细胞株，并以转染pEGZ-Term空载体的L929/mock细胞株 作为阴性对照，采用流式细胞术对杂交瘤细胞进行筛选；对所得阳性杂交瘤细胞 进行多次克隆化培养，直至获得持续稳定分泌特异性鼠抗人CD160单克隆抗体的杂 交瘤细胞株；采用Westen blot和竞争结合抑制实验，对获得的杂交瘤细胞进行生物 特性方面的鉴定；采用间接免疫荧光法和流式细胞术分析CD160在健康人PBMC 中 T细胞表面的表达。 【结果】获得l株持续稳定分泌鼠抗人CD160单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命 名为5A7 。经快速定性试纸分析鉴定，5A7 的重链为IgG ，轻链为κ链；采用本科 室建立的腹水诱生方法制备单克隆抗体，腹水的收获量平均为3ml/只，经protein G 亲和柱分离纯化。抗体的抗原表位竞争抑制试验表明，单克隆抗体5A7与商品化抗 体识别的抗原表位不同。间接免疫荧光分析结果显示：单抗5A7能够特异性识别人 CD160分子，并且能够识别健康人PBMC 中T细胞表面的CD160分子。 【结论】成功获得 l 株持续稳定分泌鼠抗人 CD160 单克隆抗体的杂交瘤细 胞株。为进一步研究CD160 分子在免疫调节中的作用提供了物质基础和实验参数。 关键词：人CD160 ；基因转染；单克隆抗体 作 者：侯 爵 指导老师：顾宗江 II 人CD160 基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制