人β-防御素-基因5′-端转录调控区dna片段的克隆及表达调控分析.pdf

四川I大学硕士研究生论文 7一端转录调控区DNA片段 人B一防御素一2基因5 的克隆及表达调控分析 研究生：汪宇辉 导师：黄宁副教授 中文摘要 抗菌肽是天然免疫的重要介质， 由复细胞生物自身合成，具有广谱 的抗菌活性，是机体防御感染的重要屏障。防御素是最早发现的抗菌肽 之一。因结构的不同，防御素被分为＆一防御素和母一防御素及0一防御素三类。 人D一防御素(humanbeta，defensin，hBD)主要由上皮细胞合成，包括 hBD一1、hBD一2、hBD．3亚类，是皮肤、粘膜免疫的重要分子。其中hBD．2 富含阳离子半胱氨酸，由41个氨基酸组成。hBD一2在皮肤、肺、气道等 粘膜上皮组织表达水平很低，但当病原菌感染时，可诱导hBD．2的大量 表达。 抗菌肽基因表达调控的研究提示：抗菌肽的诱导表达可能与多种细 胞信号传导通路有关。如果蝇抗菌肽受炎性刺激后的表达与Toll／dorsal 信号传导通路有关。新近的研究亦表明，F．Nucleatum诱导hBD一2的表 kinase，MAPK)通 达受丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein 路的效应分子p38和JNK调控，而与NF．KB无关。 ant microbial LPS刺激诱导牛气道防御素(trachealpolypeptide，TAP) 表达的转录调控机制的研究表明NF．’cB和NF一[L6元件共同调控了。rAP 基因的转录。但LPS、HSP60以及炎症预激细胞因子丁NF—OL、IL．1诱导 四川大学硕士研究生论文 B和 入肺粘膜腺上皮细胞hBD．2基因转录激活机制是否也需NF—K NF—IL6元件共同参与，目前尚未见文献报道。 1CB结合元件同源性极高(核心序列1．0，基序O．948同源)。 参照Internet基因库的hBD．2 hBD一2基因上游序列计算机分析结果，利用引物设计软件Primer5．0进行 引物设计，从中选择最佳引物，并在引物57一端分别添加绿色荧光蛋白 I与Pst I酶切位点及 报告基因质粒pEGFP．1多克隆位点中所包含的Xho 保护碱基，以SPC-A．1细胞总DNA为模板，扩增hBD．2基因上游的 NF．IL6结合位点、NF—r33结合位点、TATA盒)。扩增产物经XhoI与 Pst I双酶切，定向克隆于pEGFP．1载体，构建分别包含hBD一2基因上 游．241／．32、一510／．43两段DNA序列的绿色荧光蛋白重组报告基因质粒 重组质粒的基础上将NF一1cB结合位点进行突变，构建包含NF—IL6结合 用脂质体转染方法将三种质粒分别稳定转染至人肺腺上皮细胞系A549 细胞，用大肠杆菌LPS、IL．113、TNF—Q、HSP60刺激稳定转染细胞．通 过报告基因绿色荧光蛋白倒置荧光显微镜观察、RT．PCR反应，对LPS、 HSP60和炎症预激细胞因子IL一1 D、TNF一毡上调hBD一2基因表达的机制 做了初步的探讨。实验结果表明，hBD．2基因5 7端。241／-32序列介导了 四川大学硕士研究生论文 用，该序列含有NF—v．B结合位点，提示NF．vd3可能介导了这一作用， 而与NF—IL6元件无关。本研究为进一步探