人4-1bb(d137)在真核细胞cho中的高效表达及活性研究.pdf

人4-1BB(cDl37)在真核细胞 CHO中的高效表达及活性研究 研究生：万 兵 导师：张利宁 专业：分子免疫学 中文摘要 f 4-1BB是近年发现的TNFR超家族成员，表达在活化T细 胞表面，不表达于静止T细胞，是一种可诱导的T细胞表面 受体，具有膜型和可溶性两种形式。4-1BB及其配体是CD28／B7 共刺激信号途径之外的另一重要的共刺激分子，4-1BB介导的 协同刺激信号，能促进T细胞活化、增殖、分化，也能诱导 慢性活化T细胞凋亡。4-1BB共刺激信号可抑制活化诱导的细 胞死亡，并能在post-C028期，维持免疫系统的效能。4-1BB 单抗可促进移植物抗宿主疾病(GVHD)，加速同种异体心脏移 植排斥反应和皮肤移植排斥反应，并能消除业已存在的肿瘤。 可溶性4-1BB在类风湿性关节炎患者的病理生理过程中发挥 作用。深入研究4-1BB对探讨肿瘤的病理过程及自身免疫病 的发病机制具有潜在的意义。我们在国内率先研究了4-1BB 在正常人T细胞及其亚群的表达特点，检测了4-1BB对不同 状态T细胞增殖和凋亡的影响，探讨了4-1BB与类风湿性关 节炎(RA)及系统性红瘢狼疮(SLE)的关系。但目前尚无法 从商业途径获得4-1BB抗原，阻碍了研究的深入进行。、)／ | 目的：分别构建表达膜型、分泌型人4-1BB蛋白的重组真核 表达载体，建立高效表达人4-1BB(CDl37)的真核表达系统， 获得高效表达人4-1BB抗原的dhfr-CHO细胞株；深入研究 4-1BB及其配体在细胞信号传导中的作用，为探讨该共刺激分 子在免疫应答和疾病发生中的作用奠定基础。 ／ 一／方法： ＼ 1．膜型人4-1BB抗原真核细胞(CHO)表达系统的建立：将含 及pSV2-dhfr质粒(含二氢叶酸还原酶基因)，按2：1比例， 运用脂质体介导法共转染二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞 (dhfr-EHO)；用新霉素类似物G418筛选出阳性克隆；利用转 择系统诱导下一起高效扩增的原理，依次提高MTX的浓度(0．2 u umol／L、1．6umol／L、3．2 umol／L、0．4“mol／L、0．8 检测4-1BBmRNA转录水平；免疫细胞化学法及流式细胞术测 i-CD3活化的PBMC增殖的影响。 人4-IBB膜型抗原对ant 2．分泌型人4-1BB-hlgGiFc融合蛋白重组真核表达载体的构 cDNA的PGEM-T质粒为模板， (4-IBB-pCDNA3)和含有hIgGlFc PCR扩增，分别获得4-1BB胞膜外区和hlgGlFc目的基因片段， o【，氨苄青霉素筛选 段的重组pCDNA3质粒转化大肠杆菌DH5 山东大学硕士论文 阳性克隆，PCR及测序鉴定。 结果： 1．成功建立了高效表达膜型人4-1BB抗原的真核细胞(CHO) 共转染dhfr-CHO，用含有400“g／mI6418的F12培养基培 养2周，筛选出阳性克隆。0．2Hmol／LMTX诱导两周，运用 RT—PCR方法从诱导后的CHO细胞中扩增出一558bp大小的特 异性条带，表明4-1BB在dhfr-CHO中获得转录。免疫细胞化 学染色显示4-1BB抗原为膜型表达，0．2umol／L、0．4Hmol／L、 0．8“mol／L、1_6“mol／L以及3．2“mol／LMTX诱导的 90％，pCDNA3空载体转化细胞及空细胞对照无4-1BB抗原的表