小鼠sp检测试盒的研制.pdfVIP

中 文 摘 要 小鼠SP检测试剂盒的研制 摘 要 目的:免疫组化技术以其操作简便、敏感性高、特异性 强等优点广泛应用于基础医学的研究及临床疾病的诊断，其 应用使病理学诊断达到了一个新的高度。但是，免疫组化在 实际应用中存在许多问题，为此，科研人员做了大量实验， 发现许多因素可以影响免疫组化染色结果，如组织固定、抗 原修复、内源性抗生物素蛋白结合物、抗体质量，其中二抗 的质量对染色结果很重要。本实验用小鼠抗兔白蛋白抗体 (单抗或多抗)做免疫原或亲和原、来制备二抗，目的是探讨 并提出一种新的制备二抗的方法。将本室分离的菌株所产的 链霉亲和素((SA)用辣根过氧化物酶(HRP)标记，制备 HRP-SAo 方法:1利用细胞融合杂交瘤技术，成功地制备了 12 株、能分泌小鼠抗兔白蛋白单抗的杂交瘤细胞，经冻存后有 8株细胞仍能存活并稳定分泌单抗，将这8株细胞分别制备 腹水后，先用间接ELISA法检测腹水中单抗的亚类和效价， 再用亲和层析法纯化单抗。 2将兔白蛋白偶联于Sepharose4B亲和层析柱上用于纯化 单抗，纯化过程中收集洗脱液并浓缩，先通过琼脂双相扩散 法和分光光度计检测蛋白浓度，再用免疫电泳法鉴定单抗的 纯度，最后将单抗作为抗原偶联到4B柱上，用于纯化抗抗 体(即:山羊抗小鼠IgG)a 3用兔白蛋白免疫昆明小鼠，制备了小鼠抗兔白蛋白抗血 中 文 摘 要 清，将其用亲和层析法纯化制得小鼠抗兔白蛋白IgG，先用 琼脂双相扩散法鉴定此IgG的纯度和效价，再以其为抗原 免疫山羊，制备抗抗体。 4用亲和层析纯化后的小鼠抗兔白蛋白I泌 为抗原免疫山 羊，制备山羊抗小鼠IgG抗血清，用琼脂双相扩散法测定 该羊抗小鼠IgG抗血清效价，再用免疫电泳法鉴定其纯度。 还比较了亲和层析法纯化的小鼠抗兔白蛋白I四 和DEAE 纤维素法纯化的小鼠IgG免疫羊所制抗血清的特异性。最 后用单抗偶联的亲和层析柱纯化山羊抗小鼠IgG抗血清， 得到抗抗体。 5将抗抗体标记生物素，制备了生物素标记的二抗(即自制 二抗)，将自制二抗和中山公司、华美公司的二抗分别用于 免疫组化。测定实验组和阴性对照组切片的平均光密度，并 以其比值作为免疫比值。最后，通过比较相同一抗、不同二 抗所染切片的免疫比值，来比较二抗的特异性染色和非特异 性染色。 6用HRP标记SA，制备了HRP-SA，将自制的不同浓度的 HRP-SA和中山公司的HRP-SA工作液用于免疫组化。通过 比较相同抗体、不同HRP-SA所染切片的免疫比值，来比 较自制的HRP-SA和中山公司的HRP-SA，同时研究了自制 HRP-SA用于免疫组化的最适浓度。 结果:I单抗制备 用间接ELISA法测得5株细胞的 单抗为IgGI,I株细胞的单抗为IgG2a,2株细胞的单抗为 IgG2b，而且效价均较高(1:214_1:220)0 2亲和层析纯化单抗 8株TL抗I，‘有4株(即2B3,2E3.2A9. 5D4)的洗脱液中蛋白含量较高，琼脂双相扩散能出现沉淀 中 文 摘 要 线;另外4株(1B1,2E,,5凡、18BS)的蛋白含量较低，琼 脂双相扩散不能出现沉淀线。 32B3单抗纯度的鉴定 免疫电泳可见2B3单抗与山羊抗小 鼠血清(含有针对小鼠多种血清成分的抗体)之间形成清晰 的、边缘锐利的、单一沉淀线。 4小鼠抗兔白蛋白I泌 效价和纯度的鉴定 琼脂双相扩散 法测得小鼠抗兔白蛋白IgG效价为 1:16，出现的沉淀线不 止一条，说明小鼠抗兔白蛋白抗血清中，除了抗兔白蛋白 IgG以外，还有杭其它兔血清成分的抗体。 5山羊抗小鼠IgG抗血清效价的测定 琼脂双相扩散中发 现，将山羊抗小鼠I四抗血清做1:128倍稀释时，能与小鼠 IgG反应出现清晰的沉淀线;做1:256倍稀释时仍能与小鼠 I泌反应出现可以分辨的沉淀线，可见山羊抗小鼠I药抗血 清的效价为1:256. 6鉴定山羊抗小鼠1药 抗血清的纯度 比较亲和层析法和 DEAE一纤维素纯化的小鼠IgG免疫羊所制抗血清的特异性， 免疫电泳中发现，以亲和层析法纯化的小鼠抗兔白蛋白IgG 为免疫原、免疫山羊制备的抗血清，特异性较单一，与正常 小鼠血清反应出现一条清晰的沉淀线;以