应用原位pcr术检测石蜡切片mn血型基因型的研究.pdf

中文摘要 前 言 个人识别是以个人为研究对象，包括活体，尸体及来源于人体的生物学 性检材，应用法医学、人类学的理论和技术检测分析，确定其个体的身源。 遗传标记检测是个人识别最可靠、最确切的手段。DNA遗传标记多态 性检测技术在法医学领域中的应用，特别是具有灵敏度高、特异性强、适用 于降解DNA检材、检测方法操作简单、节省时间等特点的PCR技术的应用 和普及，使法医物证检测由细胞水平发展到分子水平，由宏观水平发展到微 观水平，由只能否定发展到可以肯定的水平，极大地扩展了法医物证的应用 范围，提高了法医物证鉴定的质量。 法医实践中某些案件却经常要求我们对送检的特殊检材一福尔马林固 定后的人体组织(石蜡包埋块或病理切片)进行同一认定和个人识别。例 如：罪犯保外就医提供的是否本人的病理组织和切片，或者是保险理赔时提 供的他人的恶性肿瘤病理切片，或是病理室工作中偶尔遇到标本的标记错 误，发现与临床资料不匹配时等案件都需要对这种特殊检材的组织来源进 行鉴定，石蜡包埋组织或者切片的DNA分型鉴定在实践中已经愈发重要。 本研究应用灵敏度高、特异性好的原位PCR技术，测定福尔马林固定 不同时间的石蜡切片组织MN血型的基因型，并对蛋白酶消化时间等主要 影响因素进行了初步的研究，以建立一种稳定、实用的检测石蜡组织切片 DNA遗传标记的方法，为法医物证鉴定和个人识别提供一种新的检测手 段。 材料与方法 样本来源和处理：样本来源：样本血液2ml、肌肉组织200mg各12例， 分别取自本校法医病理教研室12例解剖尸体(死亡后鸽小时内，未腐败 尸体)。12例血液样品制悬液备检。．同时酚／氯仿法常规提取DNA。每例 ·l· 埋，切5“m厚切片数张。运用直接凝集法检测红细胞MN表型。运用常规 PCR检测样本血液MN基因型。石蜡切片进行原位PCR检，预处理分别滴 20pJ消化，以原位扩增显色后阳性细胞占总细胞 加100mg／ml的蛋白酶K 的比值75％为标准，确定最适消化时间m1，研究不同固定时间与蛋白酶 消化的相互影响和关系，同时检测石蜡切片的MN基因型。 结 果 为MN型。 4-6．55rain、46．67 为30．41 统计学分析表明不同固定时间分组所需蛋白酶最适消化时间存在显著差异 (P0．01)。 讨 论 在法医物证实践中，经过化学处理的特殊检材，例如福尔马林固定后的 石蜡包埋组织块和切片的个人识别和来源鉴别，因为福尔马林介导的甲基 化直接影响DNA提取的效率，其中固定时间是一个重要的变异因素。在常 过程中，机械和化学的作用，也最容易导致模板DNA污染和造成DNA破 坏。 本研究根据文献合成了两条MN序列特异性引物，分别与一条共同引 物构成两个可以分别检测M、N基因的PCR反应体系。运用原位PCR技术 来对组织切片进行DNA分型，避免了提取过程中的破坏和污染，在切片上 直接进行PCR反应进行组织切片的MN基因型检测。12例样品基因分型 结果与血清型分型结果完全一致。表明本研究合成的引物质量良好，PCR 扩增条件选择适宜u引。 ·2· 本研究采用的是直接原位PCR检测方法，即在PCR反应液中，按一定 扩增的目的片段中，然后用亲和素化的酶显色系统显色观察。 本研究结合临床病理诊断实际和法医物证实践，对10％福尔马林固定 时间分别为24h，48h，72h和3个月的肌肉组织分组进行蛋白酶消化时间的 梯度研究，通过蛋白酶消化时间的筛选实验，来研究固定时间和蛋白酶消化 时间的相互影响和关系，成功地对固定时间从24h到3个月的组织石蜡包 埋切片进行了MN血型的检测，从而为法医物证实践提供原位PCR检测组 织切片的实验条件。 研究表明：PCR信号强弱与福尔马林固定时间和蛋白酶消化程度密切 相关，而最适宜的蛋白酶消化时间决定于福尔马林固定时间，蛋白酶消化时 间随着固定时间的增长而递增，这种强相关性使得充分的蛋白酶消化在原 位PCR检测中非常重要，蛋